新生兒溶血病實驗室檢測研究進(jìn)展

黃瑞英

廣西桂平市中醫(yī)院檢驗科 537200

新生兒溶血病(hemolytic disease of newborn,HDN)主要是指母嬰血型不合、紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷、丙酮酸激酶缺乏、地中海貧血、球形紅細(xì)胞增多癥而產(chǎn)生同族血型免疫反應(yīng)的遺傳性疾病。當(dāng)胎兒從父親繼承的紅細(xì)胞抗原恰為母親所缺乏時,胎兒紅細(xì)胞作為一種異抗原通過“胎盤出血”進(jìn)入母體后,刺激母體產(chǎn)生相應(yīng)的血型抗體,產(chǎn)生免疫抗體,通過胎盤絨毛膜進(jìn)入胎兒血循環(huán)與胎兒紅細(xì)胞凝集、使之破壞而出現(xiàn)溶血,引起貧血、水腫、肝脾腫大,嚴(yán)重者發(fā)生核黃疸甚至造成新生兒死亡。目前已發(fā)現(xiàn)人類有26個血型系統(tǒng)、400多個血型。每個血型系統(tǒng)在遺傳上都是獨(dú)立的,并按孟德爾法則遺傳。引起新生兒溶血病以的ABO系統(tǒng)為最多,次為 Rh系統(tǒng),其他如 MN、Kell、Duffy系統(tǒng)等血型不合引起的本病較少見。新生兒溶血病嚴(yán)重危害新生兒健康,容易造成新生兒終身與疾病相伴,所以新生兒溶血病一直以來都受到婦幼醫(yī)療學(xué)界的重視,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,目前新生兒溶血病的檢測和臨床治療手段有了很大的進(jìn)步,其痊愈率也在不斷上升,筆者對新生兒溶血病的發(fā)病原因、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查綜述如下。

1 新生兒溶血病的發(fā)病原因

1.1 Rh血型不合 Rh血型不合引起的新生兒溶血癥在我國的發(fā)病率較低。通常是母親為Rh陰性,胎兒為Rh陽性而血型不合,并引起溶血,一般第一胎不發(fā)病,而從第二胎起發(fā)病,但如果Rh陰性的母親在第一胎前曾接受過Rh陽性的輸血,則第一胎也可發(fā)病。

1.2 ABO血型不合 本病以ABO血型不合最常見,其中最多見的是母親為O型,胎兒(或嬰兒)為A型或B型。第一胎即可發(fā)病,分娩次數(shù)越多,發(fā)病率越高,且一次比一次嚴(yán)重。尚可見于母親為A型,胎兒(或嬰兒)為B型或 AB型,母親為B型,胎兒(或嬰兒)＞為B型或AB型,但少見。胎兒(或嬰兒)為O型者,可排除本病。當(dāng)然,不是所有母嬰血型不合的條件都會發(fā)生溶血,這和胎盤的致密程度、抗體的數(shù)量等多種因素有關(guān)。Rh血型不合溶血多發(fā)生在第二胎,或孕婦以前接受過輸血。這種情況下胎兒多在宮內(nèi)即發(fā)生了溶血,因此生后黃疸出現(xiàn)較早,進(jìn)展快,而且多伴有貧血、水腫、肝脾增大;而ABO血型不合第一胎即可發(fā)病,但病情與Rh溶血相比較輕,病情發(fā)展也相對緩慢[1]。

2 新生兒溶血病的臨床表現(xiàn)

2.1 胎兒水腫 嚴(yán)重者表現(xiàn)為胎兒水腫,主要發(fā)生在Rh溶血病,在胎兒期有大量紅細(xì)胞破壞,患兒全身水腫、蒼白、皮膚淤斑、胸腔積液、腹水、心音低、心率快、呼吸困難、肝脾腫大。胎盤也明顯水腫,胎盤重量與新生兒體重之比可達(dá)1∶(3～4),嚴(yán)重者可發(fā)生死胎。

2.2 黃疸 溶血病患兒黃疸出現(xiàn)早,一般在生后24h內(nèi)出現(xiàn)黃疸,并很快發(fā)展,血清膽紅素以未結(jié)合膽紅素為主。但也有少數(shù)患兒在病程恢復(fù)期結(jié)合膽紅素明顯升高,出現(xiàn)膽汁黏稠綜合征。部分ABO溶血病黃疸較輕,與生理性黃疸相似。

2.3 貧血 溶血病患兒有不同程度的貧血,以Rh溶血病較為明顯。如血型抗體持續(xù)存在可導(dǎo)致溶血繼續(xù)發(fā)生,患兒在生后3～5周發(fā)生明顯貧血(Hb＜80g/L),稱晚期貧血,多見于未換血者和已接受換血的早產(chǎn)兒中。

2.4 肝、脾腫大 嚴(yán)重病例因髓外造血,出現(xiàn)肝、脾腫大。

2.5 膽紅素腦病(bilirubin cerebritis) 新生兒溶血病可發(fā)生膽紅素腦病,足月兒膽紅素超過18mg/dl,早產(chǎn)兒膽紅素超過12～15mg/dl就要警惕發(fā)生該病。開始表現(xiàn)為神萎、吸吮反射和擁抱反射減弱、肌張力低下,12h～1d,如病情進(jìn)展,出現(xiàn)發(fā)熱、兩眼凝視、肌張力增高、抽搐、角弓反張等,可因呼吸衰竭或肺出血死亡。

3 實驗室檢查

3.1 ABO血型及Rh血型鑒定

3.1.1 ABO血型正反定型:根據(jù)紅細(xì)胞膜表面有無A抗原和(或)B抗原,將血型分為A型、B型、AB型及O型4種,可利用凝集試驗,通過正反定型準(zhǔn)確鑒定ABO血型。所謂正定型是指用標(biāo)準(zhǔn)抗A和抗B分型血清來測定紅細(xì)胞上有無相應(yīng)的A抗原或(和)B抗原;所謂反定型是指用標(biāo)準(zhǔn)A型紅細(xì)胞和B型紅細(xì)胞來測定血清中有無相應(yīng)的抗A和(或)抗B?？刹捎貌捎貌Ｆɑ蛟嚬芊ㄟM(jìn)行鑒定。

3.1.2 Rh血型鑒定:從理論上講人類紅細(xì)胞上的Rh抗原應(yīng)有 C 、c、D、d、E 、e 6種 ,但目前尚未發(fā)現(xiàn)抗d,因此也未肯定抗原,Rh抗原主要有5種。Rh血型形成的天然性抗體極少,主要是免疫性抗體,已知有抗 D 、抗E 、抗C、抗 c、抗e抗體等5種。抗 D抗體是Rh血型系統(tǒng)中最常見的抗體。Rh抗體有完全抗體和不完全抗體兩種,完全抗體在機(jī)體受抗原刺激初期出現(xiàn),一般屬于IgM型。機(jī)體再次受抗原刺激,則產(chǎn)生不完全抗體,屬于IgG型。Rh抗體主要是不完全抗體,如用5種不完全抗體的血清(抗D 、抗E 、抗 C 、抗c、抗 e)做鑒定,可將 Rh血型系統(tǒng)分為18個型別。在臨床上,因D抗原的抗原性最強(qiáng),出現(xiàn)頻率高,臨床意義又較大,故一般只做D抗原的血型鑒定。如僅用抗D血清進(jìn)行鑒定,則凡帶有D抗原者稱為Rh陽性,不帶D抗原者稱為Rh陰性。

3.2 母親IgG抗體效價測定 胎盤對抗體的吸收是選擇性的,IgG是唯一能穿過胎盤的免疫球蛋白,并且IgG通過胎盤是一個主動轉(zhuǎn)運(yùn)的過程,在妊娠24周時胎兒體內(nèi)的IgG濃度約為1.8g/L,足月時臍帶血中IgG水平可比母親高20%～30%,約為15.12g/L[2,3]。一般孕婦血清中IgG抗體效價的高低與胎兒受害程度呈正相關(guān)[4],因此,產(chǎn)前檢測孕婦血清中的IgG抗體效價對預(yù)防HDN的發(fā)生有重要的價值。胡雄燕[5]等認(rèn)為:當(dāng)母體IgG抗體效價≥1∶64時就有臨床意義,母體血清IgG抗體效價與新生兒溶血病的發(fā)生率成正相關(guān),動態(tài)監(jiān)測孕婦血清IgG抗體效價升高2個或2個以上滴度時,新生兒溶血病發(fā)生率可達(dá)73%。因此,當(dāng)丈夫為非O型血的O型血孕婦,應(yīng)常規(guī)進(jìn)行IgG抗體(抗A、抗B)效價檢測,在初次檢測到母體IgG抗體(抗A、抗B)效價較高時(≥1∶64),應(yīng)嚴(yán)密追蹤觀察,當(dāng)抗體效價≥1∶256時,應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前綜合治療[6],如靜脈注射免疫球蛋白。當(dāng)然,有些特殊的病例當(dāng)母體IgG抗體效價較高時卻沒有發(fā)生新生兒溶血病,一般認(rèn)為可能與胎兒A、B抗原的強(qiáng)弱、胎盤的屏障作用強(qiáng)以及胎兒紅細(xì)胞上的致敏抗體的量和IgG亞群有關(guān)。IgG亞群中溶血性最強(qiáng)的是IgG3[7,8]。

3.3 IgG亞類的檢測 眾所周知IgG重要的生物學(xué)活性為特異性結(jié)合抗原,并通過重鏈C區(qū)介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng),包括激活補(bǔ)體、親和細(xì)胞而導(dǎo)致吞噬、胞外殺傷及免疫炎癥,最終達(dá)到排除外來抗原的目的,其中補(bǔ)體活化作用是關(guān)鍵的一步。IgG抗體有4個亞類 IgG1、IgG2、IgG3和 IgG4,各亞類與紅細(xì)胞結(jié)合后激活補(bǔ)體的能力順序為IgG1＞IgG3＞IgG2,當(dāng)新生兒紅細(xì)胞上結(jié)合IgG2和IgG4時不發(fā)生溶血,只有結(jié)合IgG1和 IgG3時才發(fā)生溶血。IgG3和IgG1破壞紅細(xì)胞的能力不同,IgG3在介導(dǎo)單核細(xì)胞破壞抗體致敏紅細(xì)胞方面的能力比IgG1要強(qiáng)。在子宮內(nèi),IgG1抗-D引起HDN比IgG3抗-D更能導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血,但它們進(jìn)入胎兒血循環(huán)后,IgG3對紅細(xì)胞的破壞更為嚴(yán)重[9～14]。因此有必要進(jìn)行母親產(chǎn)前血清IgG亞類檢測。

3.4 直接抗人球蛋白試驗(direct antiglobulin test,DAGT) 直接試驗應(yīng)用抗人球蛋白試劑(抗IgG和/或C3d)與紅細(xì)胞表面的IgG分子結(jié)合,如紅細(xì)胞表面存在自身抗體,出現(xiàn)凝聚反應(yīng),即產(chǎn)生新生兒同種免疫性溶血。趙建萍[15]等認(rèn)為DAGT用于新生兒溶血病診斷敏感性較低,結(jié)合其他試驗進(jìn)行診斷更可靠。

3.5 游離抗體試驗 新生兒血清中的IgG抗A(B)來自母親,因此,如果在新生兒血清中發(fā)現(xiàn)有與其紅細(xì)胞不配合的IgG抗A(B)時,表明嬰兒可能受害。將待測新生兒血清分別放入三支試管,分別加入5%A、B及O型紅細(xì)胞鹽水懸液1滴,37℃致敏1h后取出,若致敏后已發(fā)生凝集,說明存在相應(yīng)抗體。游離抗體檢測血中游離抗體用于判定是否存在繼續(xù)溶血,在治療效果的觀察和病情發(fā)展的評估上有實際意義。游離抗體要及時檢測,患兒出生時間越短檢測陽性率越高。出生0～4d檢測陽性率最高,這是因為在發(fā)病24h內(nèi)抽樣檢測,新生兒血液中還有較多的游離IgG血型抗體及致敏紅細(xì)胞存在的緣故,在發(fā)病24h后隨著發(fā)病時間的延長,檢測率越來越低,這是由于新生兒血液中只有少量的游離IgG血型抗體及致敏紅細(xì)胞存在,而大部分IgG血型抗體以游離的抗原抗體復(fù)合物的形式存在,失去了反應(yīng)原性[16]。

3.6 放散實驗 也稱釋放試驗,致敏的患兒紅細(xì)胞通過加熱將抗體放散于放散液中,然后再加入酶處理的成人相應(yīng)紅細(xì)胞致敏,紅細(xì)胞上的抗原與血清中抗體在適合條件下發(fā)生凝聚或致敏。這種結(jié)合是可逆的,如果改變某些物理條件時,抗體又可以從結(jié)合的細(xì)胞上解脫下來。這種方法稱為放散實驗。先利用特殊的方法將致敏在新生兒紅細(xì)胞上的抗體放散下來(ABO血型不合時加熱放散、Rh血型不合時乙醚放散),然后再檢測放散液中的抗體,當(dāng)放散液中檢出抗體,同時新生兒紅細(xì)胞上又存在相應(yīng)抗原時,認(rèn)為釋放試驗陽性。研究結(jié)果證實釋放試驗是“三項試驗”中敏感度最高,也是判定HDN最有力的證據(jù)[17]。

3.7 血清總膽汁酸(TBA)測定 血清總膽汁酸水平是唯一可同時反映肝臟分泌狀態(tài),肝臟合成與代謝及肝細(xì)胞損傷三方面的血清學(xué)指標(biāo)。末梢血中TBA僅為1mg/L,當(dāng)膽汁排出受阻或肝功能受損,血中TBA濃度很容易升高。結(jié)果顯示,在生理性黃疸患兒中TBA只有少數(shù)的增高,而病理性黃疸患兒的 TBA大多數(shù)增高。所以在治療中進(jìn)行HDN患兒膽紅素監(jiān)測,很有必要對血清TBA進(jìn)行測定,以指導(dǎo)臨床用藥及觀察療效[18]。

4 新生兒溶血病免疫血液學(xué)實驗室檢測方法

4.1 抗人球蛋白法 HDN的免疫血液學(xué)檢查主要是檢測母體針對胎兒的免疫性抗體IgG,包括檢測孕母體內(nèi)IgG型抗體效價及檢測新生兒紅細(xì)胞被IgG抗體致敏情況。采用試管抗人球蛋白法,較靈敏,結(jié)果可靠。

4.2 微柱凝膠技術(shù) 微柱凝膠抗人球蛋白試驗的原理是孕婦IgG類抗體致敏的紅細(xì)胞和微柱內(nèi)的抗人球蛋白結(jié)合而發(fā)生凝集,不能通過凝膠微粒間隙,離心后紅細(xì)胞不能達(dá)到微柱底部;而未被IgG類抗體致敏的紅細(xì)胞不與微柱內(nèi)的抗人球蛋白結(jié)合,離心后紅細(xì)胞通過凝膠微粒間隙達(dá)到微柱底部[19]。微柱凝膠技術(shù)是建立在傳統(tǒng)血型血清學(xué)基礎(chǔ)上的一項免疫學(xué)檢測技術(shù),將凝膠分子篩技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合,在離心力作用下抗原和抗體反應(yīng)后或抗體致敏凝集紅細(xì)胞留在微柱上端或分布在凝膠中,未凝集或未致敏紅細(xì)胞通過間隙到達(dá)微柱底部,形成不同強(qiáng)度的凝集反應(yīng)[20]。微柱凝膠抗人球蛋白試驗是一種新興的試驗方法,具有簡便、快速、省時、省力,結(jié)果易于觀察,反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定,易于保存,并可以拍照長期保存圖譜等優(yōu)點(diǎn)[21]。

4.3 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法 通過檢測孕婦和新生兒體內(nèi)免疫性抗體IgG亞類判斷新生兒溶血程度越來越引起人們的關(guān)注,抗人球蛋白法只能檢測血液中總的IgG水平,檢測IgG亞類需要更為精確的方法,現(xiàn)階段國內(nèi)主要采用ELISA法[22]。ELISA法操作簡單,易于普及,但是存在一定的不足。首先影響ELISA法檢測的因素較多,酶標(biāo)本身不穩(wěn)定,易受溫度和酸堿度變化的影響[23]。并且該方法是間接測量致敏紅細(xì)胞結(jié)合相關(guān)抗體的方法,為半定量法,定量欠精確。

4.4 單核單層檢測(monocyte monolayer assay,MMA) MMA是體外功能細(xì)胞實驗,是一類評估抗體臨床意義的試驗。MMA檢測方法是根據(jù)致敏紅細(xì)胞在體內(nèi)免疫反應(yīng)而設(shè)計的體外模擬實驗,在國外該檢測方法已作為臨床診斷新生兒溶血病一個常規(guī)輔助診療手段[24]。

4.5 流式細(xì)胞術(shù)(FACS) FACS是近年廣泛應(yīng)用的細(xì)胞自動分析分選技術(shù),它可以快速測量懸浮于液體中的分散細(xì)胞的一系列生物物理和生物化學(xué)特征性參量,并根據(jù)預(yù)定的參選范圍把指定的細(xì)胞亞群分選出來。FACS可以用于抗體致敏紅細(xì)胞的檢測,在IgG抗體經(jīng)試劑紅細(xì)胞吸附后,用于血液中IgG抗體的檢測[25,26]。由于每個熒光標(biāo)記抗人IgG分子可帶有15～20個熒光基團(tuán),因此一個紅細(xì)胞只要結(jié)合幾個抗體分子,就足以被流式細(xì)胞儀檢出,極大地提高了試驗的靈敏度。

綜上所述,HDN主要由母嬰血型不合引起,隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展,并不斷應(yīng)用于臨床實踐,新生兒溶血病的檢查技術(shù)和方法也越來越多,如PCR技術(shù)也開始廣泛應(yīng)用于HDN的診斷,只有早檢查,及時診斷和治療,治愈率也較高,神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥也較少。

[1] 蔣紅周.淺談新生兒溶血病〔J〕.醫(yī)學(xué)信息,2010,23(7):2168.

[2] 郭如華,邢培清,張伯偉.弱 RhCe型家系調(diào)查〔J〕.中國輸血雜志,2004,17(4):246-247.

[3] 李勇,楊桂貞.人類紅細(xì)胞血型學(xué)實用理論與實驗技術(shù)〔M〕.北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,1999:175.

[4] Jeon H,Calhoun B,Pothiawala M,et al.Significant ABO hemolytic disease of the newborn in a g roup B infant with a group A2 mother〔J〕.Immunohematology,2000,16(3):105-108.

[5] 胡雄燕.母體IgG抗體效價與新生兒溶血病關(guān)系調(diào)查〔J〕.實用預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,17(4):723-724.

[6] 吳曉翠,陳新.新生兒黃疸〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社,2001.

[7] 金漢珍,樊紹曾.新生兒溶血病與母嬰血型不合〔M〕.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1981.

[8] 孫愛農(nóng),黃小紅,吳曉燕,等.IgG血型抗體溫和還原的應(yīng)用〔J〕.中國輸血雜志,2001,14(2):79.

[9] Nimmerjahn F,Ravetch JV.Divergent immunoglobulin G subclass activity through selective Fc receptor binding〔J〕.Science,2005,310(5753):1510-1512.

[10] Lambin P,Debbia M,Puillandre P,et al.IgG1 and IgG3 anti-D in maternal serum and on the RBCs of infants suffering from HDN:relationship with the severity of the disease〔J〕.Transfusion,2002,42(12):1537-1546.

[11] Kumpel BM.In vitro functional activity of IgG1 and IgG3 polyclonal and monoclonal anti-D〔J〕.Vox Sang,1997,72(1):45-51.

[12] Urbaniak S J,GreissM A.Rh D heamoly tie disease of thefetus and the newborn〔J〕.Blood Rev,2000,14(1):44-61.

[13] Shintaro H,et al.Placental transfer of IgG subclasses in a Japanese population〔J〕.Pediatr Int,2000,42(4):337-342.

[14] Achargui S,Benchemsi N.A quantitative determination of IgG anti-D subclasses by Elisainhemolytic disease of the newborn〔J〕.Transfus Clin Bio,2003,10(4):284-291.

[15] 趙建萍,楊慧,黃金偉.78例A BO新生兒溶血病篩查結(jié)果分析〔J〕.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2010,18(3):103-104.

[16] 詹影影.ABO血型系統(tǒng)診斷新生兒溶血病的實驗研究〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010,20(6):1421-1422.

[17] 高峰,主編.輸血與輸血技術(shù)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:102.

[18] 曾麗,黃瑞玉.血清總膽汁酸測定在新生兒溶血病中的應(yīng)用〔J〕.江西醫(yī)學(xué)檢驗,2004,22(4):343-344.

[19] 劉小信.微柱凝膠抗人球蛋白試驗檢測孕婦抗A(B)IgG抗體早期診斷ABO-HDN的研究〔J〕.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2009,15(1):40-42.

[20] 閆芳,苗天紅,孫云,等.微柱凝膠技術(shù)對新生兒溶血病直接抗人球蛋白的檢測效果〔J〕.北京醫(yī)學(xué),2009,31(11):691.

[21] Langston M M,Priter JL,Cipolone KM,et al.Evaluation of the gel system for ABO grouping and D typing〔J〕.T ransfusion,1999,39(3):300-305.

[22] 李燭,楊曉亞,李振奇,等.母嬰血型不合新生兒溶血病免疫血液學(xué)檢測進(jìn)展〔J〕.華北國防醫(yī)藥,2010,22(3):240-242.

[23] 魏東,鄧愛文,牟成惠.ICA,RIA和ELISA法測定甲胎蛋白的比較〔J〕.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2001,21(6):459-460.

[24] 嚴(yán)康峰,鄧詩禎,謝敬文,等.單核單層檢測的研究與應(yīng)用〔J〕.實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2009,27(1):59-60.

[25] 徐樹良,田愛民,陳軍浩.流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體致敏紅細(xì)胞方法的建立及初步應(yīng)用〔J〕.中國輸血雜志,2002,15(2):98.

[26] 戎霞,羅廣平,付涌水,等.流式細(xì)胞術(shù)在母嬰血型不合新生兒溶血病檢測中的應(yīng)用〔J〕.熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2008,8(8):791.