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    TGase酶法交聯(lián)改善低溫花生粕分離蛋白功能特性的研究

    2011-12-07 07:22:12任嬌艷趙謀明何鵬臣
    關(guān)鍵詞:乳狀液溶解性變性

    任嬌艷, 胡 曉, 崔 春, 趙謀明, 何鵬臣

    (華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

    TGase酶法交聯(lián)改善低溫花生粕分離蛋白功能特性的研究

    任嬌艷, 胡 曉, 崔 春, 趙謀明, 何鵬臣

    (華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

    利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)對(duì)低溫花生粕分離蛋白(PPI)進(jìn)行交聯(lián)改性,對(duì)比不同交聯(lián)時(shí)間(30,90,240 min)對(duì)PPI功能特性的影響.結(jié)果表明:TGase可促使PPI亞基發(fā)生改變并形成高分子聚合物,隨著交聯(lián)程度的上升,PPI溶解性逐漸降低.TGases限制性交聯(lián)(37℃交聯(lián)90 min)可明顯提高PPI乳狀液的穩(wěn)定性,但交聯(lián)時(shí)間過長將導(dǎo)致其制備的乳狀液乳化活性及穩(wěn)定性顯著降低.DSC分析表明,TGase適度交聯(lián)使PPI變性溫度(Td)增加,變性焓值(ΔH)降低,表明TGase交聯(lián)可使PPI熱穩(wěn)定性提高.

    低溫花生粕分離蛋白;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶;交聯(lián)

    我國花生產(chǎn)量居世界第一(年總產(chǎn)量約1 500萬噸),其主要用途是作為油料作物,用于榨油的花生約占其總產(chǎn)量的50% ~60%[1].我國對(duì)花生采用的榨油方式主要有熱壓榨、冷壓榨及溶劑萃?。ㄉ?jīng)熱壓榨后蛋白變性嚴(yán)重,其副產(chǎn)物高溫花生粕大多作為飼料使用.低溫壓榨一般與溶劑萃取聯(lián)合使用,蛋白質(zhì)變性程度低,制取的蛋白粉細(xì)膩,既可用于食品加工,又可直接生產(chǎn)花生組織蛋白,其缺點(diǎn)是溶劑不易完全除凈[2].花生粕餅高值化應(yīng)用程度低,造成蛋白資源的大量浪費(fèi).與國外相比,我國花生深加工產(chǎn)業(yè)極為薄弱,如日本的花生產(chǎn)量雖遠(yuǎn)低于我國,但其有上千家花生食品生產(chǎn)廠,人均花生食品占有量是我國的3~4倍[3].因此,研究花生粕蛋白精深加工與高值化利用具有重要意義.

    酶法改性提高花生粕蛋白的功能特性,是充分利用該蛋白資源的重要途徑之一.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase,EC 2.3.2.13)是一種可催化?;D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶,TGase催化的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)可引起蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的共價(jià)交聯(lián),從而改善蛋白質(zhì)的部分功能特性[4].TGase交聯(lián)作為蛋白改性的一個(gè)重要手段,也可用于改善動(dòng)植物蛋白的功能特性,在食品領(lǐng)域中有重要應(yīng)用,但目前國內(nèi)外關(guān)于TGase改性花生蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道較少,且尚缺乏深入的研究.本文以 TGase改性低溫壓榨花生粕蛋白,探討TGase交聯(lián)對(duì)花生蛋白功能特性的影響,以期為花生粕蛋白的精深加工與高值化應(yīng)用提供適當(dāng)參考.

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    主要材料:低溫脫脂花生粕,山東天申生物蛋白有限公司提供;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,購自江蘇一鳴生物制品有限公司.其他試劑均為分析純.

    主要設(shè)備:320-S型數(shù)顯pH計(jì),瑞士梅特勒-托利多公司;CR22G型高速冷凍離心機(jī),日本日立公司;Alpha1-4 LD plus型冷凍干燥機(jī),德國 Marin Christ公司;600 HPLC system型液相色譜儀,美國Waters公司;APV-1000型高壓均質(zhì)機(jī),丹麥APV公司;Mastersizer2000型粒度分布儀,英國Malvern Instruments Ltd;TA Q100型差示掃描量熱儀,美國TA儀器公司.

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 花生分離蛋白的制備

    取一定量的花生粕將其與水按質(zhì)量比為1∶10混合,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0,常溫?cái)嚢杼崛?1 h,離心 30 min(8 000 r·min-1),取上清液,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 值至4.5,離心10 min(8 000 r·min-1),取離心沉淀物,加去離子水,用 1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0使其充分溶解,用去離子水透析24 h,冷凍干燥制得花生分離蛋白(PPI).

    1.2.2 TGase交聯(lián)反應(yīng)

    將PPI配成蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的溶液,調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0,加入TGase(加酶量為0.5 g/100 g 蛋白),在37 ℃分別反應(yīng)30,90,240 min,反應(yīng)后冷凍干燥,制得PPI交聯(lián)樣品.

    1.2.3 乳狀液的制備

    用去離子水將蛋白樣品配成蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的溶液,調(diào)節(jié)pH值為7.0,將溶液與玉米油按質(zhì)量比為4∶1混合,采用APV均質(zhì)機(jī)在30 MPa下均質(zhì)制成乳狀液.

    1.2.4 體積排阻色譜

    體積排阻色譜(size exclusive chromatography,SEC).采用Waters 600高效液相系統(tǒng),以Protein-Pak 300SW作為分析柱(分離范圍為1萬~40萬u).此柱使用含0.2 mol/L NaCl的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)來平衡和洗脫.經(jīng)膜濾(0.45 μm)后的蛋白溶液(0.01 g/mL)進(jìn)樣于 Protein-Pak 300SW(進(jìn)樣量為20 μL),采用恒流洗脫,流速為1 mL/min,檢測波長為280 nm.

    1.2.5 鄰苯二甲醛法測定自由氨基

    鄰苯二甲醛(O-phthaldialdehyde,OPA).準(zhǔn)確稱取OPA 40.0 mg溶解于1.0 mL甲醇中,再加入0.2 g/mL的十二烷基硫酸鈉2.5 mL,硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL,β-巰基乙醇 100 μL,最后用蒸餾水定容到50 mL.測定時(shí),取4.0 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL樣品,混合均勻,放入35℃水浴中反應(yīng)2 min,后于340 nm下測吸光值A(chǔ)340.

    1.2.6 溶解性的測定

    將0.01 g/mL蛋白質(zhì)溶液調(diào)節(jié)至pH值為3.0~10.0,離心 20 min(8 000 r·min-1),上清液中的蛋白質(zhì)采用Lowry法[5]測定,利用牛血清蛋白(BSA)為參比物做標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定500 nm處吸光值.根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量和溶液中蛋白質(zhì)含量計(jì)算溶解度.

    1.2.7 粒度分布的測定

    取1 g乳狀液用1 000 g去離子水稀釋,采用粒度分布儀測定乳狀液中粒子大小及其分布,根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)設(shè)置操作參數(shù)[6-7],表面積平均粒徑d32與體積平均粒徑d43的計(jì)算公式分別為:

    式中,ni是直徑為di的脂肪球的數(shù)量.

    1.2.8 乳析率測定

    向制備好的乳狀液中添加0.02 g/mL的疊氮鈉溶液,使疊氮鈉在乳狀液中最終質(zhì)量濃度達(dá)2×10-4g/mL,以抑制乳狀液中的微生物生長,然后準(zhǔn)確吸取10 mL于具塞刻度試管中,常溫加蓋密封靜置,第20天記錄乳析層的高度.乳析率即為乳析層的高度與乳狀液高度的比值.

    1.2.9 差示掃描測量

    采用差示掃描量熱(DSC)法對(duì)蛋白樣品的變性情況進(jìn)行分析.將樣品配成蛋白質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的溶液,吸取20 μL樣液置于鋁盒中,壓片密封.氮?dú)獾乃俾试O(shè)為30 mL/min,在25~120℃進(jìn)行掃描,掃描速率為5℃/min,并選擇空密封鋁盒作為參照.所得到的DSC曲線,采用Q100-DSC分析儀進(jìn)行分析,從而得到蛋白樣品的最初變性溫度(Tm),變性溫度(Td)和變性焓值(ΔH).

    2 結(jié)果與討論

    2.1 體積排阻色譜分析

    花生分離蛋白(PPI)經(jīng)TGase催化交聯(lián)不同時(shí)間后其組分的SEC圖譜如圖1.可以看出,與未交聯(lián)的原始樣對(duì)比,經(jīng)TGase催化交聯(lián)30 min后,PPI高分子量組分(洗脫出峰時(shí)間約為4.8 min)含量明顯增加,且隨著交聯(lián)時(shí)間延長至90 min及240 min,該組分含量不斷增加.SEC圖譜的變化表明PPI的亞基在TGase的催化作用下形成高分子質(zhì)量的聚合物,且交聯(lián)程度隨著催化時(shí)間的延長而增加.

    圖1 TGase不同催化時(shí)間下PPI交聯(lián)產(chǎn)物的SEC圖譜Fig.1 SEC profiles of cross-linked PPI samples by TGase

    2.2 自由氨基含量的變化

    OPA法于340 nm測得的吸光值可反映蛋白樣品中自由氨基的含量[5].由OPA法測得的樣品自由氨基含量如圖2.由圖2可以看出,隨著TGase催化交聯(lián)時(shí)間的延長,PPI樣品的吸光值A(chǔ)340呈下降趨勢,說明PPI中的自由氨基含量逐步減少.這是因?yàn)門Gase促使蛋白質(zhì)交聯(lián)主要是通過催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基(Gln)的γ-酰胺基和賴氨酸殘基(Lys)的ε-氨基之間形成異肽共價(jià)鍵(G—L鍵)來實(shí)現(xiàn),而蛋白質(zhì)的自由氨基參與G—L鍵的形成,故自由氨基含量的降低可反映蛋白樣品中G—L鍵的增加,有相關(guān)研究證實(shí)TGase在催化谷物類蛋白如大米蛋白、燕麥蛋白時(shí)可導(dǎo)致其自由氨基含量的下降[6-7].因此,圖2的結(jié)果也表明PPI交聯(lián)程度隨著TGase催化時(shí)間的延長而提高,這一結(jié)果與SEC分析結(jié)果相符.

    圖2 PPI自由氨基含量變化Fig.2 Changes in free amino groups of PPI

    2.3 TGase對(duì)PPI溶解性的影響

    蛋白質(zhì)的溶解性是蛋白質(zhì)水化作用的重要體現(xiàn).TGase交聯(lián)處理對(duì)PPI溶解性的影響如圖3,可以看出與PPI原始樣相比,隨著交聯(lián)時(shí)間的延長,交聯(lián)程度的增加,PPI交聯(lián)后的樣品溶解性逐漸降低,高分子不溶聚合物的生成以及蛋白結(jié)構(gòu)的變化可能是導(dǎo)致溶解性下降的主要原因.除花生蛋白外,TGase交聯(lián)處理同樣會(huì)導(dǎo)致燕麥、蕓豆等植物蛋白溶解性的下降[8-9],而 Babiker等[10]研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后的大豆蛋白在pH值為2.0和pH值為8.0~12.0時(shí)其溶解性會(huì)有所增加.這種結(jié)果上的差異可能是由于不同底物蛋白在其組成與結(jié)構(gòu)上有所不同所導(dǎo)致.

    圖3 TGase交聯(lián)對(duì)PPI溶解性的影響Fig.3 Effects of TGase treatment on solubility of PPI

    2.4 TGase對(duì)PPI乳化性的影響

    蛋白質(zhì)的乳化特性可以從其制備的乳狀液的粒度分布、乳析率來進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).TGase交聯(lián)前后PPI乳狀液粒度分布的變化如圖4.由圖4可以看出,交聯(lián)時(shí)間為0,30,90 min時(shí),乳液粒度均呈單峰分布,盡管隨著交聯(lián)時(shí)間的增加峰形略向大粒徑方向偏移,但絕大部分乳液顆粒直徑均小于10 μm,但當(dāng)交聯(lián)時(shí)間增加到240 min時(shí),乳液粒度變?yōu)殡p峰分布,且大粒徑乳液顆粒(大于10 μm)所占體積約為32%.這可能是由于交聯(lián)后的蛋白其溶解性的下降導(dǎo)致其在制備乳液的均質(zhì)過程中無法迅速遷移到油水界面,從而導(dǎo)致乳液顆粒增大[10].乳狀液粒徑數(shù)據(jù)如表1.由表1可以看出,TGases處理時(shí)間超過90 min后,d32及d43極顯著增加,因此TGase處理時(shí)間不易過長,否則容易導(dǎo)致乳化活性降低.

    圖4 不同TGase交聯(lián)時(shí)間對(duì)PPI乳狀液粒度分布的影響Fig.4 Effects of different TGase treatment on particle size distribution of emulsions made with PPI samples

    表1 乳狀液平均粒徑的變化Tab.1 Changes in mean particlesize of emulsions μm

    乳析率是反映乳狀液穩(wěn)定性的重要指標(biāo).TGase交聯(lián)前后PPI乳狀液乳析率的變化見圖5.由圖5可以看出,當(dāng)PPI交聯(lián)時(shí)間從0增至90 min時(shí),樣品的乳析率逐漸降低,表明其乳狀液穩(wěn)定性逐步提高,其原因可能是蛋白分子交聯(lián)后形成了支鏈結(jié)構(gòu),分子量增加,蛋白交聯(lián)物吸附在油脂顆粒表面后可增加界面蛋白膜的厚度及抗形變能力,使被其覆蓋后的油滴顆粒不易相互碰撞而聚結(jié)[11-12].當(dāng)PPI交聯(lián)時(shí)間增至240 min時(shí),其乳狀液的乳析率反而升高,其原因可能是隨著交聯(lián)程度的進(jìn)一步增加,蛋白的溶解性急劇下降從而導(dǎo)致其乳化穩(wěn)定性有所降低.由此可知,適度交聯(lián)有利于PPI乳化穩(wěn)定性的提高.

    圖5 TGase交聯(lián)對(duì)PPI乳狀液乳析率的影響Fig.5 Effects of TGase treatment on creaming index of emulsions made with PPI samples

    2.5 熱特性分析

    PPI及其交聯(lián)物的DSC圖譜與分析結(jié)果見圖6和表2.由圖6可知,PPI的熱吸收?qǐng)D譜主要有兩個(gè)變性峰 P1和 P2,分別為其組分花生伴球蛋白(Conarachin)和花生球蛋白(Arachin)的變性峰,其中Arachin的變性溫度(P2)比Conarachin(P1)要高.PPI經(jīng)TGase催化交聯(lián)90 min和240 min的交聯(lián)物也均呈現(xiàn)兩個(gè)變性峰,但其吸熱峰值有向高溫偏移的趨勢.

    從表2可以看出,隨著交聯(lián)時(shí)間的延長及PPI交聯(lián)程度的提高,PPI組分Arachin和Conarachin的最初變性溫度(Tm)與變性溫度(Td)均呈增加趨勢,表明TGase交聯(lián)后PPI蛋白組分的熱穩(wěn)定性有所提高[13],這可能主要?dú)w因于TGase催化的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生了大量的高能異肽共價(jià)鍵從而提高了產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性.TGase交聯(lián)后PPI各組分的變性焓值(ΔH)發(fā)生不同程度的下降,表明酶促交聯(lián)作用在一定程度上導(dǎo)致花生蛋白結(jié)構(gòu)展開[13].總的來看,TGase交聯(lián)使PPI最初變性溫度(Tm)、變性溫度(Td)增加,變性焓值(ΔH)降低,表明TGase交聯(lián)可使PPI熱穩(wěn)定性提高.以往研究也發(fā)現(xiàn)TGase可提高大豆分離蛋白和蕓豆分離蛋白熱穩(wěn)定性[14-15].

    圖6 PPI及其交聯(lián)產(chǎn)物的DSC圖譜Fig.6 DSC thermograms of PPI samples with or without TGase treatment

    表2 PPI及其交聯(lián)產(chǎn)物熱特性分析Tab.2 DSC characteristics of PPI samples with or without TGase treatment

    3 結(jié)論

    花生分離蛋白經(jīng)TGase催化交聯(lián)后可使PPI亞基發(fā)生分子間交聯(lián)而生成高分子量聚合物,且隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(30,90,240 min),交聯(lián)程度增加,交聯(lián)后PPI樣品自由氨基含量減少,蛋白樣品中異肽共價(jià)鍵(G—L鍵)增加.隨著交聯(lián)時(shí)間的遞增,因生成高分子不溶性聚合物而導(dǎo)致PPI溶解性降低;交聯(lián)時(shí)間超過90 min后,乳狀液表面積平均粒徑(d32)與體積平均粒徑(d43)顯著增加,因此交聯(lián)時(shí)間不宜過長,否則將導(dǎo)致其乳化活性減小;同樣,從乳析率來看,TGases限制性交聯(lián)(37℃交聯(lián)90 min)可明顯提高PPI乳狀液的穩(wěn)定性,過度交聯(lián)反而會(huì)導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性的下降.此外,TGase交聯(lián)使PPI變性溫度(Td)增加,變性焓值(ΔH)降低,表明TGase交聯(lián)可使PPI熱穩(wěn)定性提高.

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    (責(zé)任編輯:葉紅波)

    Effect of TGase Cross-linking on Functional Properties of Peanut Protein Isolate

    REN Jiao-yan, HU Xiao, CUI Chun, ZHAO Mou-ming, HE Peng-chen
    (College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

    Transglutaminase(TGase)was used to modify peanut protein isolate(PPI)and the effect of different incubation time(30min,90min and 240min)on the functional properties of PPI was studied.The results showed that TGase cross-linking induced the change of PPI subunits and the formation of highmolecular-weight polymers.when the incubation time of TGase cross-linking was increased,the decrease in solubility of PPI was observed.It was found that limited TGase cross-linking(37℃,90 min)could obviously improve the emulsion stability of PPI but overtreatment could result in the decrease of emulsion activity and stability.The increase of Td and the decrease of ΔH showed by DSC analysis further proved that TGase cross-linking could increase the thermal stability of PPI.

    transglutaminase;peanut protein isolate;cross-linking

    TS229

    A

    1671-1513(2011)05-0016-05

    2011-07-08

    國家創(chuàng)新大學(xué)生計(jì)劃項(xiàng)目(081056131);廣東省高等學(xué)校高層次人才資助項(xiàng)目(粵教師函(2010)79號(hào)).

    任嬌艷,女,講師,博士,主要從事食品生物技術(shù)方面的研究.

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