藻粉中亞油酸GC測(cè)定的預(yù)處理方法研究

李金穗， 汪 蘋， 李?yuàn)W搏

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048)

藻粉中亞油酸GC測(cè)定的預(yù)處理方法研究

李金穗， 汪 蘋， 李?yuàn)W搏

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048)

亞油酸作為一種新興保健油脂受到越來越多的關(guān)注．研究了氣相色譜法測(cè)定異養(yǎng)小球藻藻粉中亞油酸的預(yù)處理方法．通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了優(yōu)化工藝參數(shù)．結(jié)果表明:GC測(cè)定藻粉中亞油酸的優(yōu)化預(yù)處理方法為酸催化甲酯化法，選用2 mL體積比為1∶1的正己烷/異丙醇溶液為提取劑，提取時(shí)間1 h，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的H2SO4－甲醇溶液甲酯化，1 mL乙醚萃取．優(yōu)化產(chǎn)率為3.00 mg/g．

異養(yǎng)小球藻;亞油酸;氣相色譜;預(yù)處理

近年來，人們發(fā)現(xiàn)食用較多油脂會(huì)造成高血脂、高膽固醇、肥胖、糖尿病等為消費(fèi)者所顧慮的不良影響．由此國(guó)外相繼開發(fā)出一大類新型保健型油脂，其功能主要有降膽固醇、降血脂、減肥、抗癌等保健作用，其中的主要功效成分即為多不飽和脂肪酸(PUFA):亞油酸(LA)、亞麻酸(LNA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、磷脂及現(xiàn)在新興起的結(jié)構(gòu)油脂等［1］．LA是最早被確認(rèn)的必需脂肪酸和重要的多不飽和脂肪酸［2］．研究表明，LA可維持體內(nèi)細(xì)胞膜完整，控制細(xì)胞新陳代謝，降低膽固醇水平，預(yù)防和治療心腦血管疾病等［3］．

小球藻藻粉含有豐富的LA，由于LA沸點(diǎn)較高，通過氣相色譜定量測(cè)定時(shí)需要進(jìn)行甲酯化，降低汽化溫度，因此藻粉中LA的提取條件及甲酯化條件對(duì)LA含量的測(cè)定結(jié)果有很大影響．盡管從玉米中提取測(cè)定LA有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，但從藻粉中高效提取測(cè)定LA的研究尚不多見，因此有必要對(duì)藻粉中LA的GC測(cè)定預(yù)處理方法進(jìn)行研究與探索．

本實(shí)驗(yàn)在堿酸催化酯化法的基礎(chǔ)上，通過對(duì)藻粉提取溶劑、亞油酸甲酯的萃取溶劑和酯化方法的優(yōu)化，為藻粉中 LA的 GC測(cè)定提供更好的測(cè)定方法．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻FACHB－270，購(gòu)自中科院武漢水生物研究所，通過異養(yǎng)培養(yǎng)收獲藻細(xì)胞，離心凍干制備成藻粉．

LA、亞油酸甲酯標(biāo)樣(Sigma)，正己烷、乙醚、石油醚、甲醇、硫酸、異丙醇、氫氧化鉀均為分析純．

1.2 儀器與設(shè)備

HH2SH24型電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;TGL－16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;VARIAN CP－3800型氣相色譜儀，美國(guó)Varian．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

藻粉中LA的GC測(cè)定預(yù)處理步驟為:1)從藻粉中提取LA;2)LA的甲酯化;3)用萃取劑將亞油酸甲酯萃取至有機(jī)層;4)GC測(cè)定亞油酸甲酯．實(shí)驗(yàn)流程見圖1．其中，亞油酸甲酯化過程反應(yīng)式如下:

圖1 LA的GC測(cè)定預(yù)處理流程Fig．1 Flow chart on GC determination pretreatment of LA

1.3.1 LA的GC測(cè)定預(yù)處理步驟

初步選用酸堿甲酯化法從藻粉中提取LA，稱取0.100 0 g研磨后的藻粉，加入2 mL體積比為1∶1的無水乙醚和石油醚，震動(dòng)混勻 2 h，提取液在8 000 r/min的條件下離心5 min，上清液選用酸堿催化甲酯化的方法，即加入3 mL KOH－甲醇溶液(0.5 mol/L)，70℃水浴15 min，取出并冷卻，加入4.5 mL體積分?jǐn)?shù)為3%的H2SO4－甲醇溶液，充分振蕩后70℃水浴20 min，使之甲酯化．冷卻至室溫，加入萃取劑1 mL乙醚．靜置分層后，取上層乙醚定容到1 mL，待GC測(cè)定．

1.3.2 藻粉提取劑及亞油酸甲酯萃取劑的比較

從溶劑的毒性、化學(xué)性質(zhì)以及價(jià)格方面綜合考慮，選取了4組備選提取溶劑:1)體積比為1∶1的乙醚/石油醚;2)正己烷;3)體積比為3∶2的正己烷/異丙醇;4)乙醇．3組備選萃取溶劑:1)乙醚;2)正己烷;3)石油醚．其余步驟同1.3.1．

1.3.3 酯化方法的優(yōu)化

選取3種酯化方法，分別為堿酸催化甲酯化法:步驟同1.3.1;堿催化甲酯化法:加入3 mL KOH－甲醇溶液(0.5 mol/L)，70℃水浴20 min;酸催化脂肪酸甲酯化法:加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的H2SO4－甲醇溶液，70℃水浴20 min，分別測(cè)定每種酯化方法對(duì)LA含量的影響．

1.4 正交試驗(yàn)

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)亞油酸甲酯化條件進(jìn)行優(yōu)化．試驗(yàn)因素水平見表1．

1.5 氣相色譜分析條件

用氣相色譜儀分析樣品中的脂肪酸組成．檢測(cè)條件:采用DM－35ms型安捷倫毛細(xì)管柱，分流進(jìn)樣，分流進(jìn)樣體積比30∶1，進(jìn)樣量0.000 2 mL;進(jìn)樣口溫度250℃;程序升溫條件:初始溫度150℃，保留1 min(升溫速率5℃/min)至220℃，再升溫至280℃(升溫速率20℃/min)，保留15 min;采取氫火焰 (FID)檢測(cè)器，檢測(cè)溫度280℃．各氣流速:載氣N2為 2 mL/min，H2為 30 mL/min，空氣為 300 mL/min．

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab．1 Factors and levels of orthogonai experiment

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

樣品的配制:購(gòu)得10 mg/mL的亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，用正己烷定容，配成 0.2，0.4，0.5，0.8，1.0 g/L的溶液，每個(gè)溶液分別上機(jī)測(cè)定3次，取平均值．以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2．y=2 317.308x－64.960，R2=0.995 7，說明在0.2～1.0 μg呈良好線性關(guān)系．

圖2 LA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．2 Calibration curve of LA

根據(jù)回歸曲線方程得出小球藻中LA含量的計(jì)算公式:

式中，ω為每克小球藻粉中所含LA的質(zhì)量(mg/g)，實(shí)驗(yàn)中每次藻粉用量為0.100 0 g．A為樣品經(jīng)過氣相色譜檢測(cè)到的峰面積．

1.7 加標(biāo)回收率的測(cè)定

樣品加標(biāo)回收:取兩份相同質(zhì)量的藻粉，其中一份加入定量的LA標(biāo)樣;兩份同時(shí)按相同的步驟進(jìn)行預(yù)處理，計(jì)算加標(biāo)回收率．

加標(biāo)回收率的計(jì)算公式:

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藻粉提取溶劑對(duì)LA測(cè)定含量的影響

通過對(duì)不同溶劑體系測(cè)得LA含量進(jìn)行比較，確定合適的提取劑．以不同的溶劑體系為橫坐標(biāo)，以LA含量為縱坐標(biāo)，得圖3．從圖3可見，用正己烷/異丙醇體系提取時(shí)，提取的LA含量最大，為1.87 mg/g;其次為乙醚/石油醚體系1.47 mg/g;乙醇體系時(shí)其提取率最低，只有0.67 mg/g，僅相當(dāng)于正己烷/異丙醇體系提取量的35.6%．

圖3 不同提取溶劑對(duì)LA測(cè)定的影響Fig．3 Effect of diferent solvents on determination of LA

溶劑加入藻粉時(shí)，溶劑直接從破碎細(xì)胞溶出油脂;對(duì)于未破碎的細(xì)胞，溶劑必須通過細(xì)胞壁透入細(xì)胞，溶解可溶性物質(zhì)后，細(xì)胞內(nèi)外形成濃度差，細(xì)胞內(nèi)高濃度溶液不斷向外擴(kuò)散，溶劑又不斷進(jìn)入細(xì)胞，如此往返，將藻粉中油脂提取出來．Grima等［4］曾經(jīng)比較了7種常用提取體系對(duì)球狀鞭金藻中粗脂肪的提取率，結(jié)果表明:采用正己烷/異丙醇體系的提取率較高;趙薇等［5］比較了 KOH－甲醇、乙醚－石油醚、氯仿－甲醇、乙醇、HCL－甲醇5種溶劑體系對(duì)紫球藻中花生四烯酸(AA)和EPA的影響，顯示乙醚－石油醚體系優(yōu)于乙醇體系．因此選擇正己烷/異丙醇體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究．

2.2 不同亞油酸甲酯萃取劑對(duì)LA測(cè)定含量的影響

通過不同亞油酸甲酯萃取劑對(duì)LA含量測(cè)定結(jié)果相互比較，確定合適的萃取劑．以不同的萃取劑體系為橫坐標(biāo)，以LA含量為縱坐標(biāo)，得圖4．從圖4可以得到萃取效果由強(qiáng)到弱依次是乙醚＞正己烷＞石油醚．

亞油酸甲酯的萃取劑，通過相似相容原理將甲酯化后的酯類溶解在萃取劑中，從而達(dá)到分離的效果．常見萃取劑的親脂性的強(qiáng)弱順序?yàn)?親水性則相反):甲醇＜乙醇＜丙酮＜乙酸乙酯＜乙醚＜氯仿＜苯＜石油醚＜正已烷．由此可以看出，酯類和乙醚的極性最為接近，由相近相容原理可知，用乙醚萃取效果最佳．這和實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致．此時(shí)小球藻中LA含量為2.04 mg/g．因此選擇乙醚作為萃取劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究．

圖4 不同亞油酸甲酯萃取劑對(duì)LA測(cè)定的影響Fig．4 Different methyl linoleate extraction agent on influence of LA determination

2.3 酯化方法對(duì)提取LA的影響

不同的酯化方法對(duì)亞油酸酯化程度不同，通過GC測(cè)定的亞油酸甲酯含量，選擇合適的甲酯化方法．以不同的酯化方法為橫坐標(biāo)，以LA含量為縱坐標(biāo)得圖5．

圖5 酯化方法對(duì)LA測(cè)定的影響Fig．5 Effect of diferent solvents on determination of LA

由圖5可以明顯看出，對(duì)于LA的甲酯化效果由強(qiáng)到弱依次是酸法＞堿酸法＞堿法．3種方法中酸催化脂肪酸甲酯化法最好，此時(shí)小球藻中LA質(zhì)量比為2.91 mg/g．寇秀穎等［6］對(duì)酸法和堿法兩類甲酯化方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)酸催化既適用于酯化游離脂肪酸，也適用于酯化脂肪;堿法只適合酯化脂肪，不適合酯化游離脂肪酸，酸法優(yōu)于堿法．范亞葦?shù)龋?］選用酸催化、堿催化和三甲基硅重氮甲烷(TMS)法對(duì)CLA進(jìn)行甲酯化，結(jié)果顯示酸法甲酯化后共軛亞油酸73.34%，優(yōu)于堿法，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致．唐芳等［8］采用酸法，堿酸法，堿法對(duì)山茶油脂肪酸甲酯化，顯示堿酸法優(yōu)于堿法優(yōu)于酸法，與本文有所差別．

2.4 酸催化甲酯化法優(yōu)化

在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)酸催化甲酯化條件進(jìn)一步優(yōu)化．具體設(shè)計(jì)見表2。

表2 小球藻提取LA正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Orthogonal test of LA extraction from Chlorella

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著正己烷/異丙醇的體積比由3∶1升至3∶3，LA提取的含量逐漸升高．當(dāng)正己烷/異丙醇的比例為3∶3時(shí)提取效果最好，在此條件下得出藻粉中LA的平均質(zhì)量比為2.30 mg/g．隨著提取時(shí)間的增加(1～5 h)，LA提取的含量逐漸減小，水平1提取效果最好，在此條件下得出藻粉中LA的平均質(zhì)量比為2.52 mg/g．提取時(shí)間對(duì)小球藻中不飽和脂肪酸提取的影響較大，主要是因?yàn)樾∏蛟逯胁伙柡椭舅崛菀自诟邷厍闆r下被空氣氧化，在常溫下也可被緩慢氧化，因此在選取小球藻不飽和脂肪酸提取方法時(shí)，提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)，但是提取時(shí)間過短，藻內(nèi)不飽和脂肪酸未能充分提?。S著提取溫度的升高(4～40℃)，LA提取的含量先增加后不變．當(dāng)提取溫度為20℃時(shí)提取效果最好，在此條件下得出藻粉中LA的平均質(zhì)量比為2.09 mg/g．但此因素極差為0.074，此因素對(duì)提取條件影響不顯著，可忽略不計(jì)．隨著 H2SO4體積分?jǐn)?shù)的升高(1%～3%)，LA提取的含量先升高后下降．在H2SO4體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)得到峰值，此條件下得出藻粉中LA的平均質(zhì)量比為2.28 mg/g．H2SO4－甲醇溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)也有較大影響，提高H2SO4體積分?jǐn)?shù)可使酯化更加完全，但甲醇用量增加有利于油的溶解［9］，有利于醇相的反應(yīng)，故體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)比較適合亞油酸酯化．

通過方差分析，可以看出正己烷/異丙醇、提取時(shí)間、H2SO4體積分?jǐn)?shù)三個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果影響極顯著，提取溫度對(duì)提取結(jié)果影響不大．對(duì)LA的提取結(jié)果影響因素大小順序?yàn)樘崛r(shí)間＞正己烷/異丙醇＞H2SO4濃度＞提取溫度．

綜上所述:實(shí)驗(yàn)表觀優(yōu)化條件為實(shí)驗(yàn)7(A3B1C3D2)，即當(dāng)正己烷/異丙醇為1∶1，提取時(shí)間為1 h，H2SO4－甲醇溶液中 H2SO4的體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)LA提取效果最好．此時(shí)小球藻中每克藻粉LA質(zhì)量為3.00 mg．實(shí)驗(yàn)計(jì)算較優(yōu)條件為(A3B1C2D2)，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)因素C提取溫度的極差為0.074，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響極小，且水平C2與C3平均值相差不大，因此不需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)．

2.5 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

將藻粉中加入0.5 mg LA標(biāo)樣，進(jìn)行加標(biāo)回收率的計(jì)算，結(jié)果見表3．

經(jīng)過計(jì)算整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程的加標(biāo)回收率可知，LA的加標(biāo)回收率為72%，說明還有產(chǎn)物在實(shí)驗(yàn)提取過程中存在一定程度的損失．為了更準(zhǔn)確的反應(yīng)小球藻各個(gè)脂肪酸的真實(shí)含量，還需進(jìn)一步根據(jù)回收率計(jì)算出實(shí)際值．其實(shí)際值=測(cè)定值/加標(biāo)回收率，計(jì)算得出小球藻中每克藻粉LA質(zhì)量的實(shí)際值為4.17 mg．

表3 加標(biāo)回收率測(cè)定Tab．3 Admeasurement of addition standard recovery

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)藻粉中LA的GC測(cè)定預(yù)處理?xiàng)l件的研究，確定優(yōu)化的預(yù)處理方法為:藻粉中加入體積比為3∶2的正己烷/異丙醇溶液2 mL，提取1 h，3 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的H2SO4－甲醇溶液甲酯化，1 mL乙醚對(duì)亞油酸甲酯進(jìn)行萃取．最終測(cè)定小球藻中每克藻粉含LA 3.00 mg，通過加標(biāo)回收率得出實(shí)際含LA 4.17 mg．

從異養(yǎng)小球藻中提取測(cè)定LA，可以有效地減少對(duì)玉米等糧食作物的消耗，在當(dāng)今這個(gè)糧食緊缺的時(shí)代，具有非常重要的實(shí)用價(jià)值．

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(責(zé)任編輯:葉紅波)

Sample Pretreatment Methods for Linoleic Acid in Chlorella Powder by GC Analysis

LI Jin-sui， WANG Ping， LI Ao-bo
(School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

Linoleic acid as a kind of novel functional oil，has

more and more attention．Sample pretreatment methods for linoleic acid in chlorella powder by GC analysis were studied in this paper．The optimal pretreatment conditions were established by single factor experiments and an orthogonal experiment．The best pretreatment method was acid-catalyzed methylation．The optimum parameters were listed as follows:2 mL of N-hexane and isopropyl alcohol l(1∶1)，Reaction time 1 hour，3 mL of 2%H2SO4-methanol solution for methylation，1 mL of ether for methyl linoleate extraction．Under these conditions，the content of linoleic acid was 3.00 mg/g．

heterotrophic chlorella;linoleic acid;gas chromatography;pretreatment

TS224.4

A

1671-1513(2011)05-0025-05

2011-06-02

李金穗，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⒃迳锛夹g(shù)研究;

汪 蘋，女，教授，主要從事水污染控制工程方面的研究．通訊作者．