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    特發(fā)性血小板減少性紫瘢患者外周血淋巴細(xì)胞亞群和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及臨床意義

    2011-12-03 08:08:54佟海俠馬良艷陸春偉王秋實(shí)
    關(guān)鍵詞:調(diào)節(jié)性亞群活化

    佟海俠,馬良艷,陸春偉,王秋實(shí)

    (1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院輸血科,沈陽110022;2.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室,沈陽110001)

    特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一種常見的出血性自身免疫病,但發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,難以找到真正特異而有效的治療方法。近年來,越來越多的研究表明,ITP患者除有體液免疫異常外,都存在細(xì)胞免疫異常,發(fā)病與淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子表達(dá)及功能改變有密切聯(lián)系[1]。同時研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell,Treg細(xì)胞)是維持機(jī)體免疫耐受的重要調(diào)控者,在自身免疫病中的作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。為了觀察淋巴細(xì)胞免疫功能在ITP發(fā)病機(jī)制中的可能作用及Treg細(xì)胞與ITP發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義,我們使用流式細(xì)胞分析儀檢測40例初診急性ITP患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的水平和Treg細(xì)胞的數(shù)量,并與40例健康者進(jìn)行比較,以觀察其在ITP發(fā)病中的變化和臨床意義。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料

    1.1.1 研究對象及分組:全部為中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院血液科門診及住院初診(治療前)急性ITP患者,診斷根據(jù)臨床血象和骨髓檢查確診,符合張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2],ITP組40例,男18例,女22例,年齡3~43歲,中位年齡18歲;健康對照組40例,男24例,女16例,年齡19~54歲,中位年齡35歲。

    1.1.2 主要試劑和儀器:MultiSET四色免洗淋巴細(xì)胞亞群試劑盒、FACS Lysing Solution紅細(xì)胞裂解液、人調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞檢測試劑盒(CD25-APC、CD4-FITC、Foxp3-PE)購自美國 BD 公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測方法:采集外周靜脈血2.0 mL,EDTA-K2抗凝后備用。取2支FACS專用試管,各加入50 μL充分混勻的抗凝全血,分別加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 抗體和20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19標(biāo)記的抗體。渦旋混勻,室溫避光放置15~20 min。取出加入 450 μL1×FACS 溶血素,充分混勻,避光放置15 min。24 h內(nèi)上機(jī),用MultiSET軟件獲取15000個細(xì)胞進(jìn)行檢測。

    1.2.2 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測方法:嚴(yán)格按照調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。流式細(xì)胞儀檢測分析應(yīng)用CellQuest軟件,在FSC-SSC散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群,再以CD4和SSC設(shè)門選擇CD4陽性細(xì)胞分析,分析CD25和Foxp3表達(dá),檢測結(jié)果分別以CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率表示。以CD4+T細(xì)胞中表達(dá)CD25+熒光強(qiáng)度>CD4-T細(xì)胞中CD25+熒光強(qiáng)度者定義為CD4+CD25highT細(xì)胞。收集細(xì)胞數(shù)50000個/管。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果

    ITP組CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+的比值均顯著低于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);CD8+T淋巴細(xì)胞百分比略升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),CD19+B淋巴細(xì)胞百分比則顯著高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);CD16+/56+NK細(xì)胞百分比顯著低于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。

    2.2 ITP患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明ITP患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時檢測高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞(CD4+CD25high)和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量變化。結(jié)果顯示ITP患者中CD4+CD25highT細(xì)胞比例略高于正常對照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而ITP患者CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例低于對照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 討論

    T淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起重要作用,是細(xì)胞免疫的重要環(huán)節(jié),按免疫應(yīng)答中的功能不同,可將T細(xì)胞分成輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)和抑制性T 細(xì)胞(T suppressor cell,Ts)。CD4+T 細(xì)胞是 T 輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞的表面標(biāo)志,具有輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成效應(yīng)細(xì)胞、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞以及活化巨噬細(xì)胞等功能。CD8+是抑制性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell,Tc)的表面標(biāo)志,能抑制 T 細(xì)胞活化、抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,起抑制細(xì)胞免抑和體液免抑的作用。細(xì)胞免疫與體液免疫相互促進(jìn),同時相互制約,T細(xì)胞比例失調(diào)必然導(dǎo)致B細(xì)胞的改變。CD19是與B細(xì)胞分化、活化、增殖及抗體產(chǎn)生的重要膜抗原,是鑒定B細(xì)胞的標(biāo)志之一。CD16+56+是自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞的特異性標(biāo)志,NK 細(xì)胞對B細(xì)胞分化有抑制作用,能調(diào)節(jié)吞噬作用和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

    研究表明,Th/Ts細(xì)胞的平衡在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[3]。Th細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的中心細(xì)胞,CD4+/CD8+細(xì)胞比值變化反應(yīng)機(jī)體的免疫功能狀況,比例升高表明免疫功能亢進(jìn),比例降低表明免疫功能低下。淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果顯示ITP患者外周血NK細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+比值均顯著低于對照組,CD8+T細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞高于對照組;以上結(jié)果與國內(nèi)其他文獻(xiàn)報道相同[4,5]。T細(xì)胞功能異常導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞激活,產(chǎn)生針對血小板的自身抗體可能是ITP的發(fā)病機(jī)制之一[6]。ITP患者CD19+B淋巴細(xì)胞的明顯升高提示B細(xì)胞活化可能是ITP抗血小板抗體產(chǎn)生的直接根源;另外ITP時NK細(xì)胞數(shù)量減少及活性降低,導(dǎo)致其對B細(xì)胞激活、增殖、分化和抗體應(yīng)答的抑制能力下降,從而使B細(xì)胞異?;罨?,產(chǎn)生大量自身抗體,進(jìn)而導(dǎo)致血小板的破壞增多。Johansson等[7]研究發(fā)現(xiàn),激活的NK細(xì)胞能夠抑制ITP的自身免疫反應(yīng)。

    1995年Sakaguchi等[8]首次發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞是一種專職抑制細(xì)胞,具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用,并在動物實(shí)驗(yàn)中將其去除后引發(fā)了多種自身免疫性疾病,而回輸后則可抑制上述疾病的發(fā)生。叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Fork-head/winged helix transcription factor,F(xiàn)oxp3)特異性地表達(dá)于Treg細(xì)胞,調(diào)節(jié)其發(fā)育、維持其功能,故被作為Treg細(xì)胞的特征性標(biāo)記[9]。人類體內(nèi)天然產(chǎn)生的Tregs來源于胸腺,占人外周血CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%~10%[10]。Treg細(xì)胞具有免疫無反應(yīng)性和免疫抑制性兩大功能特征。免疫無能性主要表現(xiàn)在對IL-2特異性抗原及抗原提呈細(xì)胞(APC)的刺激呈低反應(yīng)狀態(tài),免疫抑制性則表現(xiàn)在TCR介導(dǎo)的信號刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。

    我們觀察40例ITP患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比,結(jié)果顯示較正常對照組明顯增多;與羅祖軍、孫雨梅等[11,12]報道的 ITP患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞百分率低于對照組有明顯差異。考慮到ITP患者存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?;罨鳦D25也是細(xì)胞活化標(biāo)志,活化的CD4+T效應(yīng)細(xì)胞表面也表達(dá)CD25分子,很難區(qū)分這兩群功能不相同的細(xì)胞,因此CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量并不能代表真正的調(diào)節(jié)T細(xì)胞水平;如果實(shí)驗(yàn)中直接按照外周血CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較,由于混雜有一些活化T細(xì)胞在內(nèi),會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析有影響。Clare等[13]發(fā)現(xiàn)人類外周血中高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞(CD4+CD25highT細(xì)胞)具有動物實(shí)驗(yàn)中所觀察到的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所具有的低反應(yīng)性及免疫抑制性的特性,而低表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞卻不具備上述特性,故認(rèn)為CD4+CD25highT細(xì)胞就是存在于人體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。然而本研究觀察到ITP患者外周血CD4+CD25highT細(xì)胞的比例并沒有減少,但CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例卻明顯低于對照組。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3可能是CD4+CD25+T細(xì)胞中主要的調(diào)節(jié)基因,是目前公認(rèn)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志,其他的淋巴細(xì)胞如CD4+CD25-T細(xì)胞、B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞僅表達(dá)少量的Foxp3。本研究在檢測Treg細(xì)胞時,以CD4+CD25+Foxp3+來識別Treg細(xì)胞,更準(zhǔn)確地反映了ITP患者Treg細(xì)胞數(shù)量的變化。

    Treg細(xì)胞數(shù)量減少使機(jī)體內(nèi)免疫耐受平衡破壞,不能正常抑制T細(xì)胞的活化,使患者體內(nèi)存在大量活化的T淋巴細(xì)胞參與血小板的損傷。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)活動期和非緩解期ITP患者Treg細(xì)胞百分比明顯低于病情緩解期和健康人群。Sakakura等[15]研究認(rèn)為抗血小板糖蛋白抗體陽性和病情嚴(yán)重的ITP患者Treg細(xì)胞數(shù)明顯降低,病情緩解后Treg細(xì)胞數(shù)上升,同時外周血單個核細(xì)胞的Foxp3-mRNA水平明顯增高。近來研究證實(shí),Treg細(xì)胞通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng),抑制T細(xì)胞的活化及促進(jìn)某些抑制性細(xì)胞因子的分泌等,在自身免免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[16]。以上結(jié)果均提示ITP患者外周血Treg細(xì)胞比例降低,由此導(dǎo)致細(xì)胞免疫抑制功能缺陷,自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化,輔助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體。由于ITP患者發(fā)病時體內(nèi)Treg細(xì)胞水平降低,這提示我們可以以此為治療靶點(diǎn),采取一些能夠提高Treg細(xì)胞水平及增強(qiáng)其功能的免疫療法,以扭轉(zhuǎn)患者體內(nèi)的免疫紊亂,促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)。

    本研究初步證實(shí)ITP發(fā)病機(jī)制中存在淋巴細(xì)胞免疫異常和免疫功能紊亂,淋巴細(xì)胞亞群水平和Treg細(xì)胞檢測的聯(lián)合使用對ITP的診斷及療效觀察有較好的實(shí)用價值。通過促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增生分化,增強(qiáng)其免疫抑制功能,為有效運(yùn)用免疫調(diào)節(jié)手段治療難治性ITP開辟了一條新途徑。

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