普羅布考對腎小球硬化大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響

蘇雪松，周光宇，杜豐，李德天

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽110004）

腎小球硬化是多種腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)局，是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因，有數(shù)據(jù)顯示我國終末期腎病的發(fā)病率呈上升趨勢，因此抗腎小球硬化的有效治療受到越來越廣泛的關(guān)注。腎小球硬化的形成與發(fā)展是多因素參與、十分復(fù)雜且漸進的過程，它重要的病理特征是腎小球系膜細胞的過度增殖、進行性的細胞外基質(zhì)沉積、相關(guān)細胞因子的作用等，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是調(diào)節(jié)腎臟炎癥、硬化的最重要的生長因子之一［1］。本研究觀察了普羅布考對阿霉素致腎小球硬化大鼠腎組織TGF-β1的影響，探討其對腎小球硬化動物模型腎臟保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性Wistar大鼠32只，8～10周齡，體質(zhì)量200～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供。鹽酸阿霉素，購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司；普羅布考（商品名之樂），購自齊魯制藥有限公司；TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體、免疫組化染色試劑盒（即用型SABC）、DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；其余普通試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立、分組及給藥方法：所有大鼠隨機分為3組：對照組（n=8）、模型組（n=12）和普羅布考治療組（n=12）。模型組和治療組大鼠麻醉后行左腎切除術(shù)，于術(shù)后第7天按5 mg/kg經(jīng)尾靜脈注射阿霉素，術(shù)后第28天按3 mg/kg再次經(jīng)尾靜脈注射阿霉素。對照組行假手術(shù)，術(shù)后同期注射等量生理鹽水。治療組大鼠于第1次尾靜脈注射阿霉素后給予普羅布考500 mg·kg-1·d-1灌胃治療，共12周。模型組與對照組予等量生理鹽水灌胃。實驗過程中，模型組大鼠死亡4只，治療組大鼠死亡2只。

1.2.2 尿蛋白及血生化檢查：于第0、4、8和12周末時用代謝籠準確收集24 h尿，尿蛋白測定采用柳氮磺酸比濁法。心臟采血，采用日立7170A自動生化分析儀測定血清肌酐、血尿素氮和血清白蛋白。

1.2.3 腎組織病理學(xué)檢查：腎臟標本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3 μm，行常規(guī)蘇木精—伊紅（HE）和過碘酸—雪夫（PAS）染色后鏡檢。計算腎小球硬化指數(shù)（glomerulosclerosis index，GSI）：采用半定量的 RAIJ法［2］按如下公式計算：GSI=［（1×n1）+（2×n2）+（3×n3）+（4×n4）］/每張切片腎小球總數(shù)×100。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢查：采用SABC法檢測腎組織中的TGF-β1的表達，按試劑盒說明進行操作。以PBS代替一抗作為陰性對照，片中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。采用Floege半定量法［3］計分：0分，系膜基質(zhì)染色弱或缺乏；1分，不超過25%的系膜區(qū)局部染色加深；2分，26%～50%的系膜區(qū)局部染色加深；3分，51%～75%的系膜區(qū)局部染色加深；4分，75%以上系膜區(qū)染色加深，每張切片計數(shù)20個腎小球積分，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿蛋白排泄量的變化

模型組和治療組尿蛋白排泄量增加，在第4、8、12周時與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），治療組尿蛋白排泄量在各觀察時點均較模型組明顯減少（P<0.05），見表1。

2.2 各組大鼠血清肌酐、血尿素氮及血清白蛋白水平的比較

模型組與對照組相比，血清肌酐、尿素氮均升高，而血清白蛋白顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。治療組與模型組比較，血白蛋白升高，血清肌酐、尿素氮下降（P<0.05），提示腎功能得到改善，但仍重于對照組（P<0.05），見表1。

2.3 腎組織普通病理

光鏡下對照組無明顯病理改變；模型組腎小球系膜基質(zhì)中度至重度增生并呈彌漫性分布，呈現(xiàn)腎小球節(jié)段性硬化，小部分腎小球呈球形硬化，可見球囊粘連，囊壁中度增厚，毛細血管襻部分閉塞，部分代償性擴張，間質(zhì)纖維化，有炎性細胞浸潤，小管灶性擴張，蛋白管型多見；治療組上述病理改變明顯減輕（圖1）。模型組、治療組及對照組的GSI分別為139.56±31.23，81.78±24.73 和18.01±6.12，表明治療組腎小球硬化程度比模型組明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但仍重于對照組（P<0.05）。

2.4 腎小球TGF-β1的表達

對照組大鼠TGF-β1在腎小球表達極少甚至不表達；模型組和治療組的腎小球TGF-β1表達均明顯增強（圖2）。模型組、治療組和對照組的Floege評分分別為3.18±0.47，2.54±0.61 和1.62±0.24。半定量分析結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組和治療組TGF-β1的表達明顯增高（P<0.05），而治療組 TGF-β1的表達比模型組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

本實驗采用單側(cè)腎切除加重復(fù)注射阿霉素的方法建立腎小球硬化大鼠模型，該方法腎小球硬化率較高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，目前被認為是研究慢性腎功能不全比較成熟的動物模型［4］。實驗結(jié)果證實，造模大鼠表現(xiàn)為大量蛋白尿、低白蛋白血癥和腎功能惡化，且腎臟組織學(xué)改變?yōu)槟I小球系膜細胞和基質(zhì)增生、腎小球節(jié)段性硬化、間質(zhì)纖維化、蛋白管型多見，說明復(fù)制阿霉素腎硬化模型是成功的。

腎纖維化是絕大多數(shù)腎小球疾病進展至后期的一種共同的組織學(xué)改變，TGF-β1在腎纖維化中的作用涉及到細胞外基質(zhì)、細胞增殖及轉(zhuǎn)分化、炎性浸潤等各個環(huán)節(jié)，是介導(dǎo)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵細胞因子。普羅布考具有調(diào)脂、抗氧化、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、改善內(nèi)皮功能等作用，是目前有效的抗動脈粥樣硬化藥物之一，而且其在防治糖尿病及其并發(fā)癥、改善肝功能等方面的作用日漸凸現(xiàn)［5，6］。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，它在內(nèi)膜細胞和大鼠系膜細胞具有抗增殖作用［7，8］。已有研究表明，普羅布考能夠通過抑制JAK2/STAT途徑的活化，減低TGF-β1和結(jié)締組織生長因子等細胞因子的表達，從而減少高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細胞細胞外基質(zhì)積聚［9］。本研究結(jié)果顯示，在阿霉素致腎小球硬化大鼠模型中，TGF-β1的表達明顯增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），跟 Zhou 等［10］的報道相似，這提示腎小球TGF-β1表達異常增高是導(dǎo)致阿霉素腎小球硬化大鼠腎小球病理損害的機制之一，普羅布考治療組大鼠TGF-β1的表達明顯低于模型組（P<0.05），這與文獻報道［11］相似。

本實驗觀察到普羅布考可降低阿霉素腎硬化大鼠腎小球TGF-β1的表達，減少尿蛋白排泄量，改善腎功能，減輕腎組織病理損傷，這提示普羅布考對大鼠腎小球硬化的防治作用可能與其抑制TGF-β1的表達有關(guān)，但該藥延緩腎小球硬化的其他機制仍待進一步探討。

［1］Prud’homme GJ.Pathobiology of transforming growth factor beta in cancer，fibrosis and immunologic disease，and therapeutic considerations［J］.Lab Invest，2007，87（11）：1077-1091.

［2］Raij L，Azar S，Keane W.Mesangial immune injury，hypertension，and progressive glomerular damage in Dahl rats ［J］.Kidney Int，1984，26（2）：137-143.

［3］Floege J，Alpers C，Burns MW，et al.Glomerular cells，extracellular matrix accumulation，and the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney［J］.Lab Invest，1992，66（4）：485-497.

［4］王泰華，錢家麒.阿霉素腎病腎硬化動物模型的實驗改進［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，1997，6（2）：191-193.

［5］Endo K，Miyashita Y，Sasaki H，et al.Probucol delays progression of diabetic nephropathy ［J］.Diabetes Res Clin Pract，2006，71（2）：156-163.

［6］Tokushige K，Hashimoto E，Yatsuji S，et al.Combined pantethine and probucol therapy for Japanese patients with non-alcoholic steatohepatitis［J］.Hepatol Res，2007，37（10）：872-877.

［7］Iqbal M，Sharma SD，Okada S.Probucol as a potent inhibitor of oxygen radical-induced lipid peroxidation and DNA damage：in vitro studies［J］.Redox Rep，2004，9（3）：167-172.

［8］Nakamura N，Obayashi H，F(xiàn)ujii M，et al.Induction of aldose reductase in cultured human microvascular endothelial cells by advanced glycation end products［J］.Free Radic Biol Med，2000，29（1）：17-25.

［9］Du J，Wang L，Liu X，et al.Janus kinase2/signal transducers and activators of transcription signal inhibition regulates protective effects of probucol on mesangial cells treated with high glucose ［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（5）：768-772.

［10］Zhou TB，Qin YH，Lei FY，et al.ApoE expression in glomerulus and correlation with glomerulosclerosis induced by adriamycin in rats［J］.Ren Fail，2011，33（3）：348-354.

［11］Kondo S，Shimizu M，Urushihara M，et al.Addition of the antioxidant probucol to angiotensinⅡtype I receptor antagonist arrests progressive mesangioproliferative glomerulonephritis in the rat［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17（3）：783-794.