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    納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨結(jié)合VEGF修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

    2011-12-03 08:08:52顧曉東梁慶威
    關(guān)鍵詞:磷灰石組織學(xué)羥基

    顧曉東,梁慶威

    (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,沈陽110001)

    如何理想的修復(fù)骨缺損一直是骨科領(lǐng)域的難題和研究熱點(diǎn)。自體骨及異體骨移植都存在難以克服的缺點(diǎn)。組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題提供了新的思路和方法。目前,支架材料和成骨活性因子聯(lián)用修復(fù)骨缺損也成為組織工程中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合骨模仿天然骨的成分及結(jié)構(gòu)特征,具有良好的生物相容性、優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性,可為細(xì)胞提供與天然骨相類似的微環(huán)境,這有助于骨系細(xì)胞的黏附、增殖及功能發(fā)揮[1~4]。血管內(nèi)皮生長因子能促進(jìn)人工骨的早期血管化和成骨,本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨(nanohydroxyapatite/collagen,NHAC)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 修復(fù)大鼠橈骨缺損,采用10 ng、100 ng、300 ng的劑量梯度復(fù)合NHAC修復(fù)骨缺損,初步探討不同劑量VEGF修復(fù)骨缺損效果的差異以及VEGF用于骨缺損修復(fù)的適宜劑量。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物:雄性Wistar大鼠30只,體質(zhì)量180~220 g,購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

    1.1.2 試劑:納米羥基磷灰石粉末購自南京埃普瑞納米材料有限公司,膠原蛋白粉末購自湖州珍露生物制品有限公司。VEGF購自沈陽博爾美公司,由美國PeproTech公司生產(chǎn)。CD31抗體,購自武漢博士德生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 制備NHAC以及含有不同劑量VEGF的人工骨,人工骨制成后環(huán)氧乙烷消毒,無菌袋封存?zhèn)溆茫?]。

    1.2.2 動(dòng)物分組、骨缺損模型的制備及材料植入:30只Wistar大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組:空白組、單純 NHAC 植 入 組 、NHAC/10 ngVEGF、NHAC/100 ngVEGF、NHAC/300 ngVEGF,每組 6只(12側(cè)橈骨),其中前兩組為對照組,后3組為實(shí)驗(yàn)組。制備大鼠橈骨中段5 mm骨缺損模型,依據(jù)分組情況分別植入相應(yīng)材料,空白組不植入任何材料,關(guān)閉切口,不做內(nèi)外固定。術(shù)后肌注青霉素8萬U,連續(xù)3 d。

    1.2.3 大體觀察:術(shù)后觀察動(dòng)物飲食、日?;顒?dòng)能力及術(shù)后傷口愈合情況。

    1.2.4 組織學(xué)檢查:術(shù)后2、4、8周各組隨機(jī)選取2只動(dòng)物處死,截取橈骨缺損區(qū)骨段,常規(guī)制作石蠟標(biāo)本。每個(gè)標(biāo)本做厚度為5 μm的縱向切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察骨形成及塑型情況,并采用Lane-Sandhu法組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)評分。

    1.2.5 免疫組織化學(xué)血管染色及血管計(jì)數(shù):石蠟切片脫蠟水化后,一抗采用CD31抗體,常規(guī)ABC法行免疫組織化學(xué)染色。陽性染色表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒著色于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì),每張切片隨機(jī)選取3個(gè)100倍視野計(jì)數(shù),取平均值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況

    術(shù)后各組大鼠活動(dòng)及進(jìn)食可,雙前肢腫脹,約1周左右腫脹消退,2周左右切口愈合,無感染化膿等不良反應(yīng),實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠死亡。

    2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色

    術(shù)后2周:空白組骨斷端為纖維結(jié)締組織,NHAC組及各實(shí)驗(yàn)組有較多炎性細(xì)胞浸潤,有新生的島狀骨組織,各實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞生成較NHAC組多,其中NHAC/300 ngVEGF組的量在各實(shí)驗(yàn)組最多。4周:各組骨缺損斷端均可見軟骨成骨過程,并可見大量的成骨細(xì)胞,其中NHAC/300 ngVEGF組軟骨細(xì)胞量最高,NHAC組、各實(shí)驗(yàn)組的人工骨材料少量降解,部分區(qū)域有規(guī)則排列的骨小梁生成,骨小梁周圍可見類骨組織。術(shù)后8周:實(shí)驗(yàn)組的人工骨材料大部分已經(jīng)降解,新生骨組織的形成量實(shí)驗(yàn)組明顯高于NHAC組和空白組,其中NHAC/300 ngVEGF組的新骨形成量在各實(shí)驗(yàn)組中最多。實(shí)驗(yàn)組中可見大量成熟的板層狀骨組織,有規(guī)則的骨小梁形成,NHAC組新生骨的改建較各實(shí)驗(yàn)組少??瞻捉M增生不活躍。見圖1。

    2.3 Lane-Sandhu法組織學(xué)評分

    除2周時(shí)NHAC組和NHAC/10 ngVEGF組織學(xué)評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,各時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)皮生長因子/納米羥基磷灰石組組織學(xué)評分均高于納米羥基磷灰石組及空白組,其中以NHAC/300 ngVEGF組的評分在各組中最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    2.4 免疫組織化學(xué)血管計(jì)數(shù)

    復(fù)合VEGF人工骨組在早期(2周)即有大量的血管生成,明顯多于NHAC組(P<0.05);隨著人工骨的降解,新生血管逐漸增多,因此在4周內(nèi)各組血管逐漸增多(P<0.05);而隨著新生骨的改造,不成熟的毛細(xì)血管逐漸被少數(shù)主要血管取代,血管數(shù)量減少,所以復(fù)合VEGF人工骨組在第8周時(shí)血管數(shù)量減少。其中NHAC/300 ng VEGF組血管數(shù)量在各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)最多。見表2。

    3 討論

    骨的血供十分豐富,血管生成對骨修復(fù)至關(guān)重要,新生血管不僅是氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的運(yùn)輸通道,而且可為骨修復(fù)提供所需的間充質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞。缺乏良好的血供將導(dǎo)致骨愈合不良[6]。許多研究表明,在骨折愈合過程中,血管的生成要先于新骨形成[7,8]。血管內(nèi)皮生長因子不僅能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、增殖,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移,促進(jìn)血管生成[9]。而且,VEGF能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、遷移、擴(kuò)增[10]。

    局部單純應(yīng)用VEGF因缺乏可吸附的支撐物而被迅速降解或隨體液擴(kuò)散,從而不能均勻持久地分布在骨缺損部位,不但不能保證局部作用的發(fā)揮,而且還會產(chǎn)生異位成骨或血管瘤等并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)采用的NHAC是生長因子的良好載體,可以對附著的VEGF提供緩釋作用,從而使VEGF進(jìn)入體內(nèi)后不會快速擴(kuò)散和分解。

    本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色表明,各實(shí)驗(yàn)組在2周時(shí)血管生長旺盛,為快速血管化階段,在4周時(shí),血管數(shù)量達(dá)到高峰。隨著骨組織的成熟和改建,不成熟的毛細(xì)血管逐漸被少數(shù)主要血管取代,血管數(shù)量減少,在8周時(shí),各實(shí)驗(yàn)組血管數(shù)量下降。在各時(shí)間段,NHAC/300 ngVEGF組的血管數(shù)量最多,與其它各組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而空白組和NHAC組的血管數(shù)量在8周時(shí)最多。這表明VEGF能促進(jìn)人工骨的早期血管化過程,并且隨著VEGF劑量的增加,血管的生成也增加。組織學(xué)表明各實(shí)驗(yàn)組對骨缺損的修復(fù)效果要優(yōu)于單純應(yīng)用NHAC,且隨著VEGF劑量的增加,骨缺損的修復(fù)效果增加。組織學(xué)評分以NHAC/300 ng VEGF組最高,和其它組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)表明,復(fù)合了血管內(nèi)皮生長因子的NHAC比單純的納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合骨的骨修復(fù)能力更強(qiáng)。另外,血管化程度與新骨形成的數(shù)量呈正相關(guān)。正是由于血管的大量長入,使人工骨再血管化,從而為骨修復(fù)提供所需的間充質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞,進(jìn)而促進(jìn)新生骨組織的形成。

    [1]馮慶玲,崔福齋,張偉.納米羥基磷灰石/膠原骨修復(fù)材料[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2002,24(2):124-128.

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    [4]廖素三,崔福齋,張偉.組織工程中膠原基納米骨復(fù)合材料的研制[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2003,25(l):36-38.

    [5]宋坤修,何愛詠,謝求恩.納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子修復(fù)兔橈骨缺損[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(34):6624-6628.

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