大鼠頜下腺細(xì)胞降鈣素的定位研究

張永莉，李社莉，李寶莉，王炎林，施秉銀，呂雙燕，李亞

（1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 延安 716000；2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 710061）

近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，以及原位雜交免疫組化等先進(jìn)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們在頜下腺中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)或分離提取出30多種生物活性物質(zhì)，它們或直接分泌入血，或隨唾液進(jìn)入消化道再由胃腸吸收入血，對多種組織和細(xì)胞的生理活動起調(diào)節(jié)作用。其中有些因子完全達(dá)到激素的標(biāo)準(zhǔn)，故有人提出頜下腺具有內(nèi)分泌和外分泌雙重功能。我們先前曾用免疫組化的方法觀察到大鼠頜下腺內(nèi)含有降鈣素（calcitomin，CT）免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞［1］，這就意味著頜下腺能分泌降鈣素，為了證實(shí)這一結(jié)果，我們設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：8 d生SD雄性大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液，由賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司生產(chǎn)；胎牛血清，由蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)；兔抗角蛋白單克隆抗體（CK-8），北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔抗CT抗血清 由美國NeoMarkers公司生產(chǎn)；SP免疫組化染色試劑盒及DAB顯色劑，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；敏感性加強(qiáng)型原位雜交檢測試劑盒Ⅰ型為武漢BOSTER公司產(chǎn)品；地高辛標(biāo)記的CT DNA寡核苷酸探針由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠頜下腺細(xì)胞培養(yǎng)方法：在無菌條件下，大鼠斷頸處死后獲得頜下腺，剪碎、消化、離心，用差速黏貼法清除纖維細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，2～3 d后首次換液，8～9 d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定細(xì)胞來源及進(jìn)行降鈣素的細(xì)胞定位：取培養(yǎng)第5天的細(xì)胞爬片，4%甲醛固定，采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法，按試劑盒說明操作，兔抗鼠CK8抗體及降鈣素一抗的濃度分別為1∶400和1∶25。陰性對照：用PBS代替一抗，相同條件，同批次染色，鏡下觀察。

1.2.3 CT原位雜交：用多聚賴氨酸處理過的蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞長滿95%～100%時取出，按試劑盒說明操作，陰性對照：用不含探針的雜交緩沖液代替含探針的雜交液，鏡下觀察。

1.2.4 CT探針的引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank上登錄的哺乳動物的氨基酸保守區(qū)來設(shè)計(jì)，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，為5，DIG修飾，堿基數(shù)31 個，分別是：5′-CCCATAATAGCCCAGAG AACAGCCAGAGAGG-3′，引物的 Tm 值 70.8，包含的堿基個數(shù)：A12 G8 C9 T2，分子量9542。

2 結(jié)果

2.1 頜下腺細(xì)胞的形態(tài)

倒置顯微鏡下見體外培養(yǎng)的原代腺細(xì)胞第3天開始細(xì)胞貼壁、伸展變形，有的形成克隆，增殖的細(xì)胞呈形態(tài)一致的立方形，多邊形和圓形，8～9 d后見細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的80%，呈集落生長，鵝卵石樣排列（圖1），可傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞形態(tài)與原代相似。

2.2 CK8及CT免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果

細(xì)胞爬片進(jìn)行所培養(yǎng)細(xì)胞的來源鑒定，分別用兔抗角蛋白單克隆抗體（CK-8）及兔抗鼠CT作為一抗，用SP免疫組化染色試劑盒進(jìn)行染色，DAB顯色。CK8免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，胞核呈藍(lán)色，背景不著色，陽性細(xì)胞很易鑒別。陰性對照片，細(xì)胞質(zhì)不著色，呈陰性反應(yīng)（圖2，4）。頜下腺細(xì)胞CT免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)陽性細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)呈黃色，著色好，胞核呈藍(lán)色（圖3），陰性對照不著色（圖4）。

2.3 CT原位雜交結(jié)果

雜交信號陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)紫色，細(xì)胞核呈紅色，背景不著色，陽性細(xì)胞很易辨認(rèn)。在所培養(yǎng)的大鼠頜下腺細(xì)胞CTmRNA雜交信號分布很廣泛，而且一致，信號物質(zhì)位于頜下腺腺泡細(xì)胞的細(xì)胞膜及胞質(zhì)內(nèi)，胞核呈陰性，陰性對照片細(xì)胞質(zhì)未染色，呈陰性反應(yīng)，胞核呈紅色。（圖5，6）

3 討論

CT分布于甲狀腺C細(xì)胞，它是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝的重要激素之一。頜下腺屬于消化腺，其可產(chǎn)生消化酶參與食物的初步消化。近年來人們發(fā)現(xiàn)頜下腺又可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)［2］，在大鼠頜下腺中的顆粒曲管細(xì)胞能合成、儲存、釋放近30種生物活性多肽，如上皮生長因子、血管舒緩劑、胰島素、內(nèi)皮素、肝細(xì)胞生長因子等［3］。陸續(xù)還有新的生物活性物質(zhì)在大鼠頜下腺被發(fā)現(xiàn)。如：付建芳等［4］發(fā)現(xiàn)頜下腺有卵泡刺激素及黃體生成素的表達(dá)，陳蕾等［5］觀察到大鼠頜下腺有黃體生成素及其受體的表達(dá)等。還有報(bào)道［6］促性腺激素釋放激素及其受體可共存于頜下腺等組織中。我們先前曾用免疫組化的方法觀察到大鼠頜下腺漿液性腺泡細(xì)胞及混合性腺泡的漿液細(xì)胞內(nèi)含有CT免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)，推測大鼠頜下腺可以合成和釋放CT。為進(jìn)一步證實(shí)上述推論，我們設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。通過體外培養(yǎng)大鼠頜下腺細(xì)胞，并用CK8抗體鑒定其確系上皮細(xì)胞來源，但是所培養(yǎng)的上皮細(xì)胞是否為漿液性細(xì)胞，不好確定；再用兔抗鼠CT一抗進(jìn)行所培養(yǎng)大鼠頜下腺細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示頜下腺細(xì)胞呈CT免疫反應(yīng)陽性，細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，確定其細(xì)胞質(zhì)含有CT，與我們先前免疫組化結(jié)果一致［1］；用地高辛標(biāo)記的CT寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交，觀察到：大鼠頜下腺細(xì)胞呈CT雜交信號陽性反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)紫色，胞核呈紅色，背景不著色。以往報(bào)道頜下腺分泌生物活性物質(zhì)多采用免疫組化的方法，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)是先前免疫組化研究的深化，首次從細(xì)胞水平及基因水平證實(shí)了頜下腺能合成和分泌CT，但通過何種細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不得而知，有待進(jìn)一步研究。我們推測：甲狀腺與頜下腺以及胃腸胰同是由內(nèi)胚層分化形成的，它們在結(jié)構(gòu)和功能方面密切相關(guān)。因此，頜下腺上皮細(xì)胞與甲狀腺C細(xì)胞可能為同源細(xì)胞，頜下腺也參與體內(nèi)鈣磷代謝的調(diào)節(jié)。

［1］戴光榮，張永莉，施秉銀.大鼠頜下腺降鈣素的免疫組織化學(xué)定位［J］.解剖學(xué)報(bào)，2006，37（1）：99-101.

［2］Mizrachi D，Shemesh M.Follicle-stimulating hormone receptor and its messenger ribonucleic acid are present in the bovine cervix and can regulate cervical prostanoid synthesis［J］.Biol Reprod，1999，61（3）：776-784.

［3］Gresik EW，Hosoi K，Kurihara K，et al.The rodent granular convoluted tubule cell-an update［J］.Eur J Morphol，1996，34（3）：221-224.

［4］付建芳，黃威權(quán)，王世鄂，等.大鼠下頜下腺卵泡刺激素、黃體生成素的分布及與促性腺激素釋放激素受體的共定位研究［J］.解剖學(xué)報(bào)，2004，35（6）：652-655.

［5］陳蕾，白宏偉，孫緒德.大鼠頜下腺黃體生成素及其受體的定位、核心片段的克隆及序列分析［J］.解剖學(xué)報(bào)，2007，38（5）：572-576.

［6］于輝，唐旭，呂葆真，等.卵泡刺激素受體在大鼠下頜下腺及胃的定位和分布研究［J］.解剖學(xué)報(bào)，2006，37（3）：337-339.