Cry1Ac殺蟲蛋白對甜菜夜蛾飛行能力的影響

江幸福， 陳 建， 羅禮智， 張 蕾

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

轉(zhuǎn)Bt基因作物以其高效表達(dá)對害蟲有致死作用的殺蟲蛋白、提高作物產(chǎn)量以及不污染環(huán)境等優(yōu)點已被越來越多的國家批準(zhǔn)種植，種植面積逐年增加［1］。然而，隨著轉(zhuǎn)Bt作物種植面積的擴(kuò)大以及種植時間的延長，一些弊端也逐漸顯現(xiàn)出來，最為突出的問題是作物中有殺蟲活性的Bt蛋白的表達(dá)不穩(wěn)定以及害蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性［2－3］。同一植株，不同的生長發(fā)育階段，不同的組織器官中表達(dá)的殺蟲蛋白水平差異明顯［4－6］，較低表達(dá)水平的殺蟲蛋白不能有效地毒殺害蟲。同時，隨著轉(zhuǎn)Bt作物對害蟲選擇壓的提高以及害蟲的不斷進(jìn)化，害蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性也逐漸顯現(xiàn)出來［7－10］。為延緩害蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性，科學(xué)家在明確害蟲對Bt殺蟲蛋白抗性機(jī)制的基礎(chǔ)上，通過多種方法和手段防止害蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性。包括“高劑量／庇護(hù)所策略”、多基因聚合策略以及特異性表達(dá)等，以減少產(chǎn)生耐受昆蟲種群的環(huán)境選擇壓，抑制耐受性昆蟲種群抗性的發(fā)展。其中，“高劑量／庇護(hù)所策略”能夠有效保持一定比例非抗性的等位基因，通過與攜帶抗性基因的異性交配，稀釋抗性基因頻率，從而延緩耐受高劑量毒素昆蟲的產(chǎn)生。美國、加拿大、西班牙法定種植一定面積的非轉(zhuǎn)Bt作物以及我國小農(nóng)種植模式提供的天然庇護(hù)所均取得了很好的效果［11－13］。然而這種抗性治理策略的前提是要保證取食Bt殺蟲蛋白后存活并羽化的成蟲有足夠的飛行能力，確保其能夠成功飛離轉(zhuǎn)Bt作物的“陷阱”而與庇護(hù)所作物上的敏感種群交配、繁衍雜合子的敏感種群。如果取食一定劑量Bt殺蟲蛋白后羽化的成蟲不能成功飛離連片種植的轉(zhuǎn)基因作物田，這種“高劑量／庇護(hù)所策略”將不能有效實施。因此，評價不同濃度Bt殺蟲蛋白對害蟲飛行能力的影響無疑不僅會對這種策略的可行性和有效性提供試驗依據(jù)，而且對于闡明Bt田中的遷飛性害蟲的種群動態(tài)、遷飛規(guī)律以及其潛在的抗性治理策略均有重要的理論與實際意義。

甜菜夜蛾是一種遠(yuǎn)距離遷飛害蟲［14－16］，除為害蔬菜外也對棉花、玉米等造成重大損失［17－21］。隨著我國轉(zhuǎn)Bt基因（表達(dá)Cry1Ac）棉花大面積種植，在很好地控制了棉花主要靶標(biāo)害蟲的同時，由于大大減少了轉(zhuǎn)Bt基因棉花田中化學(xué)殺蟲劑使用量，以及甜菜夜蛾對Bt的不敏感性，導(dǎo)致近年來轉(zhuǎn)Bt基因棉花田中甜菜夜蛾有嚴(yán)重發(fā)生趨勢［20，22－23］。目前，國內(nèi)有關(guān)轉(zhuǎn)Bt基因作物對甜菜夜蛾抗蟲性評價主要研究轉(zhuǎn)Bt基因作物或Bt蛋白對其生長發(fā)育、存活以及繁殖等參數(shù)的影響作用［24－26］，而對成蟲飛行能力的影響缺乏研究。本文主要研究甜菜夜蛾取食含不同濃度Cry1 Ac蛋白的人工飼料后存活并羽化出的成蟲飛行能力的差異，以期為轉(zhuǎn)Bt基因棉花田中甜菜夜蛾種群動態(tài)規(guī)律及其潛在的“高劑量／庇護(hù)所”抗性治理策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗蟲源

所用蟲源采自北京市郊區(qū)大蔥田地，經(jīng)本實驗室在室內(nèi)用人工飼料［27］累代繁殖后，選擇發(fā)育良好的蟲源作為供試材料。

1．2 Cry1Ac殺蟲蛋白干粉

Cry1 Ac殺蟲蛋白干粉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所中?？妻r(nóng)科技有限公司提供（北京）。分離菌株來源于蘇云金桿菌庫斯塔克亞種subsp．kurstaki HD－1 菌株的突變 菌株HD－1Ac（產(chǎn)生Cry1Ac蛋白）。純度在95%以上。蛋白干粉于－70℃超低溫冰箱中保存，使用時用蒸餾水溶解。

1．3 幼蟲飼養(yǎng)及成蟲飛行能力測試

幼蟲帶毒人工飼料的配制及飼養(yǎng)方法同陳建等［28］的方法。成蟲飛行能力測試用蟲為取食含不同濃度Cry1 Ac殺蟲蛋白人工飼料后存活的幼蟲，化蛹、羽化出的1日齡（未取食）雌雄蛾。由于成蟲未取食補(bǔ)充營養(yǎng)，所以其飛行能力的差異能反映幼蟲期食物的影響作用。測試方法同江幸福等［29］方法。

1．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

處理間不同參數(shù)經(jīng)方差統(tǒng)計分析差異顯著后，用LSD法進(jìn)行差異顯著性測定。統(tǒng)計軟件為SAS 8．0。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2．1 幼蟲取食含不同濃度Cry1Ac殺蟲蛋白人工飼料存活并羽化的雌蛾飛行能力

甜菜夜蛾幼蟲取食含不同濃度Cry1 Ac蛋白人工飼料后，存活并羽化的1日齡（未取食）雌蛾飛行能力差異顯著（圖1）。體現(xiàn)在不同幼蟲飼料條件下羽化的雌蛾飛行距離（df＝4，F(xiàn)＝7．22，p＜0．000 1）、飛行時間（df＝4，F(xiàn)＝7．20，p＜0．000 1）和飛行速度（df＝4，df＝4，F(xiàn)＝3．88，p＝0．0049）均差異顯著。取食含較低濃度Cr y1 Ac殺蟲蛋白（25μg／g和50μg／g）的人工飼料有促進(jìn)成蟲飛行的傾向，盡管與取食不含Cr y1 Ac蛋白的對照相比，成蟲飛行距離、平均飛行速度和飛行時間未達(dá)到顯著增加的水平。隨著人工飼料中Cry1 Ac蛋白濃度的升高，羽化的雌蛾飛行能力顯著下降（p＜0．05）。

圖1 甜菜夜蛾幼蟲取食含不同濃度Cry1Ac殺蟲蛋白人工飼料羽化的1日齡雌蛾飛行能力

為進(jìn)一步分析不同濃度Cry1Ac殺蟲蛋白對雌蛾飛行能力的影響，參照江幸福等［30］的方法，對不同處理組間的強(qiáng)飛個體進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，取食含25μg／g和50μg／g Cry1 Ac蛋白人工飼料羽化的雌蛾強(qiáng)飛行個體比例較高，飛行距離超過40 k m的個體比例分別達(dá)到33．3%和43．3%。而隨著人工飼料中Cry1 Ac蛋白濃度的進(jìn)一步升高，羽化的雌蛾強(qiáng)飛行個體比例顯著下降，取食含200μg／g Cr y1 Ac蛋白人工飼料羽化的雌蛾飛行距離超過40 k m的個體僅為10% （圖2）。按飛行時間和平均飛行速度劃分，也表現(xiàn)出相同的趨勢（圖2）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，幼蟲取食較低濃度的Cr y1 Ac蛋白對雌蛾飛行能力有明顯促進(jìn)作用，而濃度過高則顯著抑制成蟲的飛行。

2．2 幼蟲取食含不同濃度Cry1Ac殺蟲蛋白人工飼料存活并羽化的雄蛾飛行能力

甜菜夜蛾幼蟲取食含不同濃度Cry1Ac蛋白的人工飼料羽化的1日齡（未取食）雄蛾飛行距離（df＝4，F(xiàn)＝11．18，p＜0．000 1）、飛行時間（df＝4，F(xiàn)＝13．42，p＜0．000 1）和飛行速度（df＝4，F(xiàn)＝8．04，p＜0．000 1）也差異顯著。盡管在較低濃度Cr y1 Ac蛋白（25μg／g和50μg／g Cr y1 Ac）的人工飼料飼養(yǎng)下存活并羽化的雄蛾飛行能力與取食無Cry1Ac蛋白的人工飼料相比，其飛行距離、飛行時間和飛行速度均未表現(xiàn)出升高的趨勢，但這3種條件下各項飛行參數(shù)均無顯著差異（p＞0．05）。隨著人工飼料中Cry1Ac蛋白濃度的進(jìn)一步升高，雄蛾飛行能力顯著下降（p＜0．05）。

進(jìn)一步分析幼蟲取食含不同濃度Cry1Ac殺蟲蛋白人工飼料存活并羽化的雄蛾強(qiáng)飛個體比例的差異（圖4）。結(jié)果表明，取食不含Cry1Ac蛋白、含25μg／g和50μg／g Cr y1 Ac蛋白人工飼料羽化的雄蛾強(qiáng)飛行個體比例較高，而隨著人工飼料中Cry1Ac蛋白濃度的進(jìn)一步升高，雄蛾強(qiáng)飛行個體比例顯著下降，取食含200μg／g Cry1Ac蛋白人工飼料羽化的雄蛾飛行距離超過40 km的個體僅為10．3%。按飛行時間和平均飛行速度劃分，也表現(xiàn)出相同的趨勢（圖4）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，幼蟲取食較低濃度的Cry1Ac蛋白對雄蛾飛行能力無抑制作用，而濃度過高則顯著抑制雄蛾的飛行。

圖4 甜菜夜蛾幼蟲取食含不同濃度Cry1Ac殺蟲蛋白人工飼料羽化的1日齡雄蛾飛行能力頻次分布

3 討論

幼蟲食物（寄主植物）的質(zhì)量與數(shù)量通常是影響昆蟲生長發(fā)育、存活與繁殖等種群參數(shù)的重要因素。對于遷飛性昆蟲，幼蟲食物質(zhì)量與數(shù)量（寄主適合度）的下降通常還是周圍棲息地條件惡化的環(huán)境指示劑。一定程度的食物質(zhì)與量的下降有助于誘導(dǎo)成蟲遷飛型的分化。如黏蟲幼蟲在周期性的短時食物缺乏條件下，羽化的成蟲有增加遷飛的傾向，但隨著幼蟲食物條件的進(jìn)一步惡化，不僅會顯著降低種群增長趨勢，而且還會顯著抑制成蟲飛行，從而影響其種群動態(tài)。持續(xù)饑餓的黏蟲，其生長發(fā)育、繁殖和飛行等參數(shù)均顯著下降［31］。與適宜的飼料（人工飼料與甘藍(lán)）相比，取食較不適宜的玉米苗的甜菜夜蛾飛行能力也會顯著下降［27］。本文結(jié)果表明，甜菜夜蛾幼蟲取食含較低Cry1 Ac濃度的人工飼料（25μg／g和50μg／g）不僅沒有顯著抑制其成蟲的飛行能力，相反卻有增加遷飛的傾向，表現(xiàn)在強(qiáng)飛行個體比例明顯增加，從而為成功逃避轉(zhuǎn)Bt基因作物做好準(zhǔn)備，表明一定程度Bt殺蟲蛋白的脅迫會顯著促進(jìn)甜菜夜蛾遷飛型的分化。但隨著飼料中Cry1Ac濃度的進(jìn)一步升高，成蟲飛行能力顯著下降，從而喪失逃避轉(zhuǎn)Bt作物的機(jī)會，也會逐漸增加種群的選擇壓力，引起B(yǎng)t的抗性風(fēng)險。

根據(jù)甜菜夜蛾在我國的發(fā)生危害和遷飛行為規(guī)律［32－33］，每年進(jìn)入我國黃淮海地區(qū)轉(zhuǎn)Bt棉田危害的甜菜夜蛾通常是在棉花生長的中后期，即棉花開花、現(xiàn)蕾和結(jié)鈴期。與葉片中高表達(dá)的Bt殺蟲蛋白相比，棉蕾、棉鈴中的表達(dá)量相對較低，而甜菜夜蛾對較低濃度Bt蛋白的不敏感性［23］加劇了其對Bt蛋白的抗性風(fēng)險。另一方面，近年來我國黃淮海地區(qū)轉(zhuǎn)Bt基因棉在有效控制棉鈴蟲（Helicover pa ar miger a）等靶標(biāo)害蟲的同時，并不能有效殺死甜菜夜蛾，而與普通非轉(zhuǎn)Bt基因棉相比，噴施常規(guī)化學(xué)殺蟲劑次數(shù)的明顯減少等因素引起轉(zhuǎn)Bt基因棉上甜菜夜蛾種群暴發(fā)成災(zāi)。但至今田間仍未監(jiān)測到甜菜夜蛾對Bt殺蟲蛋白的抗性，盡管室內(nèi)汰選試驗表明，甜菜夜蛾對Bt殺蟲蛋白的抗性產(chǎn)生是可能的［34］。取食較低濃度亞致死劑量的Bt殺蟲蛋白導(dǎo)致甜菜夜蛾成蟲遷飛傾向的增加，從而成功飛離Bt作物并與庇護(hù)所作物上的敏感種群雜交，稀釋抗性基因頻率是甜菜夜蛾在田間不易形成Bt抗性的重要因素之一。因此，建議在轉(zhuǎn)Bt作物生態(tài)安全性評價研究中，除評價目標(biāo)殺蟲蛋白對害蟲的生長發(fā)育、存活和生殖等影響外，還應(yīng)增加對取食亞致死劑量Bt殺蟲蛋白后存活并羽化的遷飛性昆蟲飛行能力的評價內(nèi)容，從而為全面分析轉(zhuǎn)Bt基因作物對遷飛性害蟲種群動態(tài)規(guī)律的影響以及抗性治理策略提供科學(xué)依據(jù)。

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