深綠木霉T2菌株對(duì)百合疫霉拮抗作用及機(jī)制

梁巧蘭， 王 芳， 魏列新， 徐秉良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院／草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）

百合疫霉（Phytophthor a nicotianae Bredeet de Haan）是危害百合莖基部的主要病原菌，引起百合疫病。近年來(lái)在百合種植區(qū)發(fā)生普遍，大棚種植區(qū)發(fā)病率為11．8%，而露地種植區(qū)發(fā)病率為19．1%，嚴(yán)重影響百合產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益［1］。目前，采用化學(xué)藥劑防治效果不理想，同時(shí)還引起農(nóng)藥殘留、農(nóng)藥污染及抗藥性菌株出現(xiàn)等問(wèn)題，因此，有必要大力開展生物防治植物病害研究。

木霉 （Trichoder ma spp．）是一類較理想的生防菌。人們已相繼發(fā)現(xiàn)木霉對(duì)18個(gè)屬29種病原真菌表現(xiàn)出拮抗作用［2］，其中對(duì)一些土傳植物病原菌具有很好的防治效果，包括絲核菌屬（Rhizoctonia）、小核菌屬（Sclerotium）、鐮刀菌屬（Fusariu m）、腐霉屬（Pythiu m）、疫霉屬（Phytophthor a）等12個(gè)屬的病原菌［3－4］。木霉的作用機(jī)制包括抗生、寄生、溶菌、競(jìng)爭(zhēng)和誘導(dǎo)抗性，并具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用［3］。木霉用于防治百合疫霉病的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。為此，對(duì)具有拮抗作用的深綠木霉（Trichoderma atroviride）對(duì)百合疫霉拮抗作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

深綠木霉T2菌株、百合疫霉由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存；培養(yǎng)基：PDA（馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基）、PDB（馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基）。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 深綠木霉T2菌株與百合疫霉菌對(duì)峙培養(yǎng)

制備PDA培養(yǎng)基，將培養(yǎng)2 d、直徑為5 mm的深綠木霉菌塊與百合疫霉菌塊對(duì)接于直徑90 mm的培養(yǎng)皿邊緣，另將深綠木霉、百合疫霉菌塊分別接于培養(yǎng)皿中央的純培養(yǎng)作為對(duì)照，每處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察兩菌的生長(zhǎng)情況，記錄生長(zhǎng)半徑。

1．2．2 深綠木霉T2菌株對(duì)百合疫霉菌拮抗作用方式觀察

在PDA培養(yǎng)基中央放置一塊20 mm×20 mm無(wú)菌蓋玻片，在左側(cè)距蓋玻片40 mm處接種深綠木霉，右側(cè)距蓋玻片20 mm處接種百合疫霉。28℃恒溫培養(yǎng)。設(shè)置12個(gè)重復(fù)。分別在兩種菌培養(yǎng)24、36、48、60 h時(shí)，取下蓋玻片，放在載玻片上，顯微觀察兩種菌絲之間的作用方式，并用數(shù)碼顯微照相儀照相。

1．2．3 深綠木霉T2菌株發(fā)酵液對(duì)百合疫霉病菌菌絲的抑制作用

將培養(yǎng)3 d的深綠木霉發(fā)酵液8 000 r／min離心10 min，分別將15 mL上清液倒入培養(yǎng)皿中，接入百合疫霉菌塊。淺層培養(yǎng)5 d后觀察性狀。以滅菌的上清液中培養(yǎng)百合疫霉菌塊為對(duì)照。每處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。

1．2．4 深綠木霉T2菌株代謝產(chǎn)物對(duì)百合疫霉病菌抗生作用

1．2．4．1 深綠木霉T2菌株發(fā)酵液對(duì)百合疫霉病菌的抗生作用

試驗(yàn)設(shè)PDB直接發(fā)酵和在PDB中加入20 g百合疫霉干菌絲進(jìn)行發(fā)酵2個(gè)處理，在裝有100 mL上述2種PDB的三角瓶中分別接入直徑5 mm深綠木霉T2菌塊。在28℃、150 r／min條件下發(fā)酵，設(shè)6個(gè)重復(fù)，分別于2、4、7 d取樣，在無(wú)菌條件下將發(fā)酵液先用濾紙過(guò)濾，再用直徑35 mm的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，將10 mL兩種濾液分別加入90 mL PDA中（50℃左右），搖勻倒成平板，接上直徑5 mm的百合疫霉菌塊，設(shè)置6個(gè)重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)，5 d時(shí)觀察、測(cè)量并記錄生長(zhǎng)情況。

1．2．4．2 深綠木霉T2菌株易揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)百合疫霉的拮抗作用

對(duì)扣培養(yǎng)法測(cè)定［5］：在PDA平板上接種已活化2 d、直徑為5 mm的深綠木霉菌塊，28℃恒溫培養(yǎng)2d后，在其上方蒙上雙層無(wú)菌的圓形玻璃紙（玻璃紙直徑比培養(yǎng)皿直徑大10 mm），再將剛接種過(guò)直徑為5 mm百合疫霉菌塊的PDA平板（與接種深綠木霉菌塊的PDA同樣大小）倒扣其上，封口膜密封后，28℃恒溫培養(yǎng)。以空白PDA平板與百合疫霉平板對(duì)扣培養(yǎng)作對(duì)照。設(shè)6個(gè)重復(fù)。接種后每隔24 h用十字法交叉測(cè)量百合疫霉菌落大小，計(jì)算其菌絲生長(zhǎng)抑制率，連續(xù)測(cè)5 d。菌絲生長(zhǎng)抑制率計(jì)算方法如下：

1．2．4．3 深綠木霉T2菌株難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)百合疫霉的拮抗作用

圓盤濾膜 法 測(cè) 定［5－6］：鋪雙層無(wú)菌玻璃紙于PDA平板上，在玻璃紙中央接種已活化2 d、直徑為5 mm的深綠木霉菌塊，28℃恒溫培養(yǎng)。設(shè)置6個(gè)重復(fù)。待深綠木霉菌絲長(zhǎng)滿玻璃紙前，將玻璃紙移去。在平板中央接種已活化5 d的百合疫霉菌塊，28℃下恒溫培養(yǎng)。以不接深綠木霉菌塊的PDA平板接種百合疫霉作對(duì)照。接種后每隔24 h用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算其菌絲生長(zhǎng)抑制率，計(jì)算方法同上。

1．3 深綠木霉T2菌株溶菌酶β－1，3－葡聚糖酶活性的測(cè)定

待測(cè)酶液的準(zhǔn)備：將1～8 d的深綠木霉發(fā)酵液，8 000 r／min離心20 min去除菌絲，以上清液作為酶液放置于4℃冰箱中備用。

發(fā)酵液中β－1，3－葡聚糖酶活力的測(cè)定：參考El Ghaouth［7］和中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所［8］的方法進(jìn)行，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)5次，以每s產(chǎn)生還原糖1 n mol的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2．1 深綠木霉T2菌株對(duì)百合疫霉菌拮抗作用

對(duì)峙培養(yǎng)中兩菌的生長(zhǎng)速率均比各自在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)有所減弱，但深綠木霉T2生長(zhǎng)速率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，與純培養(yǎng)的生長(zhǎng)勢(shì)相同；而百合疫霉的生長(zhǎng)速率逐漸減小，與純培養(yǎng)的生長(zhǎng)勢(shì)相反。并且在對(duì)峙培養(yǎng)60 h時(shí)，深綠木霉T2與百合疫霉的生長(zhǎng)速率比值達(dá)到3．68，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)中兩者的比值2．36（圖1）。

圖1 深綠木霉、百合疫霉生長(zhǎng)速率比較

PDA平板上的深綠木霉T2與百合疫霉接觸后，兩者菌絲在交界處互相纏繞，深綠木霉T2的菌絲在百合疫霉菌落邊緣菌絲上打成許多綠色結(jié)。且深綠木霉T2相對(duì)于百合疫霉來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)速度要快得多，覆蓋了平板的4／5（圖2a），表明深綠木霉T2在營(yíng)養(yǎng)和空間上具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

深綠木霉對(duì)百合疫霉拮抗作用方式研究表明：24 h時(shí)深綠木霉T2與百合疫霉菌各自生長(zhǎng)，在蓋玻片邊緣均能看到兩菌菌絲，但還未接觸，只是深綠木霉菌絲較百合疫霉菌絲長(zhǎng)，且數(shù)量多。36 h時(shí)在顯微鏡下可以觀察到兩者菌絲相接觸，但接觸面小，從外觀上還看不到木霉抑制疫霉生長(zhǎng)的現(xiàn)象；到48 h時(shí)便可以明顯看到深綠木霉T2沿著百合疫霉菌絲或纏繞在百合疫霉菌絲上生長(zhǎng)，并在疫霉菌絲上產(chǎn)生大量的分支，此時(shí)深綠木霉T2已經(jīng)產(chǎn)生吸器伸入到疫霉菌絲內(nèi)（圖2b，c）；60 h時(shí)深綠木霉T2明顯抑制了百合疫霉菌絲的生長(zhǎng)，其菌絲降解、不能繼續(xù)擴(kuò)張（圖2d）。

2．2 深綠木霉T2菌株發(fā)酵液對(duì)百合疫霉病菌菌絲的抑制作用

在未滅菌的深綠木霉T2上清液中培養(yǎng)的疫霉菌塊，僅在初期長(zhǎng)出細(xì)小菌絲后便無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)，而在滅菌后的上清液中，疫霉菌塊仍可以繼續(xù)生長(zhǎng)，形成大塊菌絲團(tuán)。從而證實(shí)深綠木霉發(fā)酵液能夠抑制百合疫霉菌絲（圖2e）。

2．3 深綠木霉T2菌株對(duì)百合疫霉病菌抗生作用測(cè)定

10%深綠木霉T2發(fā)酵液對(duì)百合疫霉的抑制效果隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，其中發(fā)酵2 d的抑制效果為31．17%，而發(fā)酵7 d的抑制率已升至46．61%。說(shuō)明深綠木霉能夠通過(guò)產(chǎn)生抗生物質(zhì)來(lái)抑制百合疫霉菌的生長(zhǎng)。但在加有百合疫霉菌絲的PDB中進(jìn)行發(fā)酵處理時(shí)，與PDB發(fā)酵相比，其抑制率呈遞減的趨勢(shì)，發(fā)酵7 d的抑制率僅為用PDB發(fā)酵的31．43%，這表明百合疫霉菌絲對(duì)深綠木霉產(chǎn)生抗生物質(zhì)并沒(méi)有誘導(dǎo)作用（表1）。方差分析表明2、4、7 d的深綠木霉PDB發(fā)酵液和含有百合疫霉菌絲的深綠木霉PDB發(fā)酵液對(duì)百合疫霉的抑制率之間均存在極顯著差異（圖2f，g）。

表1 10%深綠木霉發(fā)酵液對(duì)百合疫霉病菌的抑制效果1）

2．4 深綠木霉T2菌株代謝產(chǎn)物對(duì)百合疫霉的拮抗作用

圓盤濾膜法和對(duì)扣培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)果表明，深綠木霉T2產(chǎn)生的難揮發(fā)性和易揮發(fā)代謝產(chǎn)物對(duì)百合疫霉菌絲生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，且在72 h時(shí)抑菌率均達(dá)到最大值，分別為88．24%和80．00%，以后菌落直徑不再增大。方差分析表明深綠木霉兩種代謝產(chǎn)物在24 h和72 h對(duì)百合疫霉抑菌率均存在極顯著差異，難揮發(fā)代謝產(chǎn)物48 h的抑菌率介于兩者之間，易揮發(fā)代謝產(chǎn)物48 h的抑菌率和72 h的差異不顯著（圖2h，i，表2）。

圖2 深綠木霉T2對(duì)百合疫霉的拮抗作用

表2 深綠木霉代謝產(chǎn)物對(duì)百合疫霉菌的影響1）

2．5 深綠木霉T2菌株溶菌酶β－1，3－葡聚糖酶活性測(cè)定

深綠木霉T2發(fā)酵液中可產(chǎn)生能夠溶解真菌細(xì)胞壁的β－1，3－葡聚糖酶，且發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活性有一定影響。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。在5 d達(dá)到峰值，為18．54 U（圖3）。

圖3 發(fā)酵時(shí)間與β－1，3葡聚糖酶活性的關(guān)系

3 討論

據(jù)報(bào)道木霉菌的有些種如綠色木霉（Trichoderma viride）和哈茨木霉（T．har zianu m）的拮抗機(jī)制主要是通過(guò)重寄生發(fā)揮其防病作用［9］。辛雅芬等［10］研究認(rèn)為拮抗木霉菌的生防機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)抗病性和協(xié)同拮抗作用。李梅云等［11］研究發(fā)現(xiàn)不同木霉菌株對(duì)同一病原菌的作用機(jī)制不同，如木霉菌株TR13、TR14、TR17對(duì)煙草疫霉（Phytophthora parasitica var．nicotianae）的作用機(jī)制中TR13、TR14的競(jìng)爭(zhēng)作用較好；3個(gè)木霉菌株均產(chǎn)生β－1，3葡聚糖酶、纖維素酶并參與煙草疫霉細(xì)胞壁的消解，以TR13與TR14酶的活性較高；本研究也發(fā)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、抗生作用和溶菌作用是深綠木霉T2對(duì)百合疫霉拮抗作用的主要機(jī)制；另外，深綠木霉T2產(chǎn)生的β－1，3葡聚糖酶對(duì)百合疫霉菌細(xì)胞壁的消解也起到了重要作用。對(duì)于深綠木霉T2能否產(chǎn)生纖維素酶參與百合疫霉細(xì)胞壁的消解等問(wèn)題本試驗(yàn)尚未涉及還有待于進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)深綠木霉易揮發(fā)性與難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均能抑制百合疫霉病原菌的生長(zhǎng)，多種拮抗作用方式并存對(duì)于深綠木霉抑制百合疫霉病原菌生長(zhǎng)起到了關(guān)鍵作用，這與木霉菌株TR17既可產(chǎn)生非揮發(fā)性物質(zhì)又可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)分別通過(guò)抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的作用方式影響煙草疫霉生長(zhǎng)的研究結(jié)果相一致［11］。但究竟這兩種抗生物質(zhì)何種占主導(dǎo)地位、抗生物質(zhì)以何種作用方式起抑菌作用、抗生物質(zhì)定性分析以及其對(duì)動(dòng)物與植物有無(wú)毒性等問(wèn)題還有待于進(jìn)一步探討。

另外有研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基種類及培養(yǎng)基厚度均對(duì)木霉的生長(zhǎng)和重寄生有重要影響，減少培養(yǎng)基中葡萄糖含量可以增強(qiáng)木霉的重寄生作用和抑菌效果。因此篩選適用的基質(zhì)對(duì)于制備深綠木霉生防制劑具有重要意義［12］。

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