海南省胡椒瘟病病原鑒定及發(fā)生規(guī)律

桑利偉， 劉愛(ài)勤＊， 譚樂(lè)和， 曾會(huì)才， 孫世偉， 李繼鋒

（1．中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，萬(wàn)寧 571533； 2．海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，萬(wàn)寧 571533； 3．中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

胡椒是一種重要的熱帶香辛植物，原產(chǎn)于印度西高止山脈的熱帶雨林中，目前我國(guó)海南、廣東、廣西、云南、福建等?。▍^(qū)）均有種植。海南是中國(guó)胡椒的主產(chǎn)地。胡椒瘟病是一種氣候依賴性病害，常在雨季時(shí)發(fā)生。它是由疫霉菌感染而引起的一種傳染力很強(qiáng)的土傳性病害［1］，自引種種植以來(lái)，胡椒瘟病就一直是危害我國(guó)胡椒生產(chǎn)的首要病害。葉片上的病斑是鑒定瘟病很重要的標(biāo)志。植株下層的葉片最先感病，開(kāi)始為淺褐色或灰黑色水漬狀斑點(diǎn)，斑點(diǎn)迅速擴(kuò)大成黑褐色、圓形或菱形病斑，邊緣呈放射狀擴(kuò)展。病情嚴(yán)重的胡椒園能導(dǎo)致全園毀滅。

Muller于1936年首次記載并鑒定出胡椒瘟病的病原為棕櫚疫霉胡椒變種（Phytophthor a pal mivora var．piperis）。其后，又相繼有人報(bào)道了胡椒瘟病病原，并被歸入棕櫚疫霉（P．pal mivor a）中。由于其形態(tài)特征與其他種不同，作為一個(gè)新變異體，也稱為Phytop hthor a pal mivor a （Butl．）Butler MF4；又因它與馬來(lái)西亞的辣椒疫霉（Phytophthor a capsici）極其相似，因而又定名為辣椒疫霉［2－3］。國(guó)內(nèi)僅張開(kāi)明［4］等1991年對(duì)中國(guó)胡椒種植區(qū)胡椒瘟病病原菌進(jìn)行了分離、鑒定，并證明辣椒疫霉和寄生疫霉為中國(guó)胡椒瘟病的主要病原菌。作者于2008年從海南省不同地區(qū)采集病樣，對(duì)胡椒瘟病病原進(jìn)行了分離、鑒定，并研究了該病的發(fā)生流行規(guī)律，以期為大田防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 病原分離

從中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所基地（萬(wàn)寧市）、海南農(nóng)墾國(guó)營(yíng)東紅農(nóng)場(chǎng)（瓊海市）、海南農(nóng)墾國(guó)營(yíng)東昌農(nóng)場(chǎng)（?？谑校┎杉肺敛〔∪~，剪取5 mm×5 mm大小病健交界處葉片，先于75%乙醇中浸8～10 s后，再于0．1%升汞溶液中消毒30 s，滅菌蒸餾水洗3～4次，用滅菌的濾紙吸干表面水分，接種于選擇性V8培養(yǎng)基，配制方法參照鄭小波［5］的方法。于室溫下培養(yǎng)2 d，挑取菌落邊緣生長(zhǎng)旺盛的一塊菌絲，轉(zhuǎn)移至另一V8培養(yǎng)基上純化，分別得到 HP1（東昌農(nóng)場(chǎng)）、HP2（香飲所）、HP3（東紅農(nóng)場(chǎng)）3個(gè)菌株保存到試管斜面培養(yǎng)基備用。

1．2 病原鑒定

1．2．1 孢子囊的誘導(dǎo)產(chǎn)生和形態(tài)觀察

將V8平板上長(zhǎng)好的供試菌株菌落切成0．5 cm×0．5 cm小方塊，移于滅菌水、過(guò)濾滅菌水中以刺激孢子囊的產(chǎn)生，待孢子囊大量產(chǎn)生后，用0．5%棉藍(lán)乳酚油制片固定。描述菌落形態(tài)、鏡檢孢子囊形態(tài)，測(cè)量孢子囊大小及主菌絲直徑并拍照［6］。

1．2．2 分離菌株的r DNA ITS測(cè)序分析

在形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上，選取3個(gè)胡椒瘟病疫霉菌分離菌株提取DNA，采用通用引物P1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′和 P4：5′－TCCTCCGCTTATT GATATGC－3′對(duì)r DNA ITS1、5．8S及ITS2序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、凝膠回收、連接p MD18－T Vector（購(gòu)自Ta Ka Ra公司）載體和轉(zhuǎn)化E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，對(duì)經(jīng)鑒定為重組子的菌落培養(yǎng)液穿刺培養(yǎng)過(guò)夜，連同甘油保存管寄上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將測(cè)得的序列去掉引物序列和載體序列后輸入 www．ncbi．nl m．nih．gov進(jìn)行Blastn分析，參照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行。

1．3 致病性測(cè)定

將3株供試菌株分別移于V8瓊脂平板上培養(yǎng)10 d，然后在平板上加3～5 mL滅菌水刮平板，配制孢子囊懸浮液（濃度在300個(gè)／mL以上）。用孢子囊懸浮液室外噴霧接種1片胡椒葉表面，空白對(duì)照用無(wú)菌水噴霧接種胡椒葉表面，7 d后觀察發(fā)病情況。此外，參試的疫霉菌株還有煙草疫霉（Phytophthor a nicotianae）2株（A1、A2交配型各1株）、棕櫚疫霉（P．pal mivora）2株（A1、A2交配型各1株），均采取同樣接種方法進(jìn)行致病性測(cè)定。

1．4 發(fā)生規(guī)律觀察

2008－2009年連續(xù)2年進(jìn)行。方法是：在香飲所19號(hào)胡椒園內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)小區(qū)，每小區(qū)選10株，小區(qū)面積50 m2，共50株。每隔10 d調(diào)查1次，每月調(diào)查3次，計(jì)算每個(gè)月的平均發(fā)病率［8］。試驗(yàn)小區(qū)生長(zhǎng)季節(jié)不進(jìn)行藥劑防治，水肥管理及農(nóng)事操作正常進(jìn)行。2008年和2009年的每月平均降雨量、平均溫度及相對(duì)濕度等氣象資料由萬(wàn)寧市氣象局提供。運(yùn)用SPSS軟件，分別分析病害發(fā)生率同降雨量、溫度及相對(duì)濕度等氣象因子之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株形態(tài)特征

3株菌株的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征一致，在V8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，菌落白色，棉絮狀或放射狀，邊緣較清晰（圖1）。氣生菌絲粗5～9μm，無(wú)隔膜，基生菌絲柔韌，未見(jiàn)膨大體，偶見(jiàn)厚垣孢子。在無(wú)菌水中，均可形成大量孢子囊，孢囊梗傘狀分支或簡(jiǎn)單合軸分支；孢子囊形態(tài)、大小變異甚大，從近球形、腎形、梨形、橢圓形到不規(guī)則形，可見(jiàn)顆粒狀內(nèi)含物，大小為（50～110）μm×（25～60）μm，乳突明顯，呈半球形，單個(gè)，偶見(jiàn)雙乳突，排孢孔寬5～7μm；孢子囊易脫落，具長(zhǎng)柄，柄長(zhǎng)20～100μm（圖2、圖3）。其形態(tài)大小與已報(bào)道的辣椒疫霉相同。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 孢子囊及其柄的形態(tài)大小

圖3 孢子囊乳突及排孢孔

2．2 r DNA－ITS的序列分析

結(jié)果表明，去除引物結(jié)合區(qū)，所獲得的3個(gè)菌株r DNA－ITS基因序列長(zhǎng)度均為802 bp（Gen Bank登錄號(hào)分別為FJ887797、FJ887798和FJ887799），包括18S核糖體RNA基因部分序列，ITSⅠ區(qū)、5．8S核糖體RNA基因和ITSⅡ區(qū)的完全序列，及28S核糖體RNA基因部分序列。將HP1、HP2和HP3菌株的核糖體DNA－ITS基因在Gen Bank中進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的100個(gè)ITS序列菌株全部為疫霉屬菌，HP1、HP2、HP3與它們的同源性為98%～100%，其中同源性最高的前11個(gè)菌株的序列一致性達(dá)99%以上（表1），且這11個(gè)菌株均為辣椒疫霉（Phytophthor a capsici），這進(jìn)一步確認(rèn)了形態(tài)鑒定的結(jié)果。用DNA MAN4．0進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，菌株HP1、HP2和HP3的核糖體DNA－ITS序列同源性為99．83%，相對(duì)于 HP1菌株，HP2菌株在102位點(diǎn)處有一個(gè)堿基發(fā)生突變（C→T），HP3菌株在541、693和779位點(diǎn)處分別有一個(gè)堿基發(fā)生突變（C→T、G→A和G→T）。說(shuō)明辣椒疫霉同種內(nèi)的不同個(gè)體之間的ITS序列是非常保守的。所以，可根據(jù)辣椒疫霉與其他疫霉的ITS序列的變異較大區(qū)域設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR方法檢測(cè)胡椒瘟病。

圖4 供試菌株r DNA－ITS基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表1 Gen Bank中與供試菌株r DNA－ITS序列同源性最高的11個(gè)菌株

2．3 致病性測(cè)定結(jié)果

進(jìn)行致病性測(cè)定的3株供試菌株接種3 d后均表現(xiàn)典型的胡椒瘟病癥狀（圖5），而空白對(duì)照和參試的煙草疫霉（Phytophthor a nicotianae）（A1、A2交配型各1株）、棕櫚疫霉（P．pal mivor a）（A1、A2交配型各1株）接種1周后均未表現(xiàn)胡椒瘟病癥狀。從接種發(fā)病的病斑上分離的病原菌經(jīng)滅菌水誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的有乳突孢子囊，形態(tài)特征與接種菌株一致，說(shuō)明3株供試菌株為胡椒瘟病的病原菌，而供試的煙草疫霉、棕櫚疫霉不是胡椒瘟病的致病菌。

圖5 致病性測(cè)定結(jié)果

2．4 發(fā)生規(guī)律

由表2、表3可知：該病一般從3月初開(kāi)始發(fā)病，9－10月為發(fā)病高峰期；1－2月，由于氣溫低雨水少，基本不發(fā)??；3月上旬－5月中旬，平均氣溫在25～27℃，雨水較多，相對(duì)濕度較大，開(kāi)始發(fā)??；5月下旬至8月下旬，由于持續(xù)的高溫天氣，雨水減少，發(fā)病逐漸減弱；9月上旬－11月上旬，由于平均氣溫回落到25～26℃，連續(xù)多雨，相對(duì)濕度大，這一時(shí)期胡椒瘟病發(fā)生危害最為嚴(yán)重；隨后氣溫逐漸降低，雨量減少，發(fā)病減弱，12月上旬已基本不發(fā)病。2009年3月中旬至5月中旬，由于降雨量大，持續(xù)降雨天數(shù)多，也出現(xiàn)一個(gè)發(fā)病小高峰。這種情況在大多數(shù)年份幾乎沒(méi)有發(fā)生過(guò)。SPSS相關(guān)性分析結(jié)果表明：發(fā)病率與降雨量之間為顯著正相關(guān)（R＝0．708～0．763，p＝0．004～0．01），降雨量越大，持續(xù)降雨天數(shù)越多，發(fā)病率越高。

表2 2008年氣象因子與胡椒瘟病發(fā)生流行的關(guān)系1）

表3 2009年氣象因子與胡椒瘟病發(fā)生流行的關(guān)系1）

3 討論

本文首次根據(jù)形態(tài)特征和核糖體DNA－ITS的序列分析將海南胡椒瘟病的病原菌鑒定為辣椒疫霉（Phytophthor a capsici）。張開(kāi)明等1991年對(duì)中國(guó)胡椒種植區(qū)胡椒瘟病病原菌進(jìn)行了分離、鑒定，并證明辣椒疫霉和寄生疫霉為中國(guó)胡椒瘟病的主要病原菌。但本次鑒定的供試菌株沒(méi)發(fā)現(xiàn)有寄生疫霉，可能是調(diào)查采樣的范圍不夠廣，供鑒定的不同地區(qū)來(lái)源的菌株還比較少。研究結(jié)果還表明，來(lái)自海南的胡椒瘟病菌與危害辣椒和番木瓜的辣椒疫霉菌株間存在極高的相似性，絕大部分菌株的ITS序列同源性為99%以上。

胡椒瘟病的發(fā)生流行與氣象因子有極密切的關(guān)系。在氣象因子中，降雨（特別是臺(tái)風(fēng)雨后連續(xù)降雨）是病害流行的主要因素。病害的發(fā)生和流行主要取決于當(dāng)年的雨量。據(jù)海南省部分地區(qū)5個(gè)流行年的雨量的初步分析，每年流行季節(jié)的降雨量和當(dāng)年發(fā)病有極密切的關(guān)系。年雨量在2 000 mm以上的植椒區(qū)，流行期9—10月（個(gè)別年份9—11月）兩個(gè)月的總降雨量超過(guò)1 000 mm時(shí)，就可能局部發(fā)生和流行；如流行期兩個(gè)月的總雨量超過(guò)1 000 mm，持續(xù)雨天在15 d以上，加上臺(tái)風(fēng)暴雨的影響，則可導(dǎo)致大面積瘟病流行。

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