抗草甘膦雜草及其檢測(cè)方法發(fā)展現(xiàn)狀

陳景超， 張朝賢， 黃紅娟， 魏守輝

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜草鼠害生物學(xué)與治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑，由美國(guó)孟山都公司于1971年研制成功，可以防除一年生和多年生雜草。由于其殺草譜廣，低毒、低殘留，在世界范圍內(nèi)廣泛使用。轉(zhuǎn)基因作物自1996年推廣以來，得到快速發(fā)展，到2010年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積達(dá)到1．48億h m2，15年種植面積增長(zhǎng)了87倍。其中耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物種植面積占60%以上，而耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物種植面積占到耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物的95%以上［1］。

我國(guó)是草甘膦生產(chǎn)大國(guó)，其中80%用于出口，2010年我國(guó)草甘膦出口總量為519 943 t，比2009年增長(zhǎng)1．9%［2］。我國(guó)也是草甘膦應(yīng)用大國(guó)，1973年我國(guó)開始進(jìn)行草甘膦藥效試驗(yàn)，起初主要應(yīng)用于果園，后來隨著少耕免耕等耕作方式以及作物行間定向保護(hù)性噴霧技術(shù)的發(fā)展［3］，草甘膦在我國(guó)需求量越來越大。耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的種植，不僅能減少除草開支，還能緩解我國(guó)大豆等一些重要糧食長(zhǎng)期依賴進(jìn)口而被國(guó)外企業(yè)操控的局面［4］。

草甘膦的長(zhǎng)期、單一使用也產(chǎn)生了諸多嚴(yán)重問題：一些對(duì)草甘膦不敏感的雜草，轉(zhuǎn)變?yōu)槲：ψ魑锏闹饕s草［5－6］；草甘膦的長(zhǎng)期使用還會(huì)影響土壤微生物［7］，加大大豆根部病害幾率［8］；而最為嚴(yán)重的是抗草甘膦雜草的出現(xiàn)，從20世紀(jì)90年代開始，抗草甘膦雜草不斷涌現(xiàn)，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，掌握科學(xué)快速檢測(cè)抗性雜草的方法以便及時(shí)采取措施非常重要。

本文介紹了抗草甘膦雜草的發(fā)生、發(fā)展現(xiàn)狀，以及檢測(cè)方法的發(fā)展，為我國(guó)抗草甘膦雜草的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)提供一定依據(jù)，為抗草甘膦作物的安全生產(chǎn)提供科學(xué)保障。

1 抗草甘膦雜草發(fā)展現(xiàn)狀

1．1 草甘膦作用機(jī)理

草甘膦通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中的5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶（5－enolpyr uvylshiki mate－3－phosphate synt hase，EPSPS，EC 2．5．1．19），使磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyr urate，PEP）與莽草酸－3－磷酸（shiki mate－3－phosphate，S3P）合成5－烯醇式丙酮酸－3－磷酸莽草酸（5－enolpyr uvylshikimate－3－phosphate，EPSP）過程受阻，導(dǎo)致芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成阻斷而引起植物死亡［9］。

1．2 抗草甘膦雜草的發(fā)展

由于草甘膦與EPSPS具有多結(jié)合位點(diǎn)、在環(huán)境中殘留量低等特點(diǎn)，人們一直認(rèn)為雜草對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的幾率極低［10］。然而，1996年，第1種抗草甘膦雜草硬直黑麥草（Loliu m rigidu m）在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，其對(duì)草甘膦的抗性達(dá)到11倍［11］，雜草對(duì)草甘膦不易產(chǎn)生抗藥性的說法被打破。隨著耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷擴(kuò)大，草甘膦的用量越來越大。這種簡(jiǎn)便的除草方式雖然給人類帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，但也使得抗草甘膦雜草不斷出現(xiàn)。截至2010年，全球14個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)了21種抗草甘膦雜草［12］。

從1997年到2002年抗草甘膦雜草新種類的發(fā)展并不十分嚴(yán)重，6年時(shí)間只發(fā)現(xiàn)了牛筋草（Eleusine indica）［13］、多 花 黑 麥 草 （Loliu m multif lor u m）［14］、小白酒草（Conyza canadensis）［15］3種雜草對(duì)草甘膦產(chǎn)生了抗性。但從2003年開始，抗草甘膦雜草的種類每年都以2～3種的速度迅速增長(zhǎng)，截至2010年，8年時(shí)間其種類增加了17個(gè)。

抗草甘膦雜草種類增加越來越快，對(duì)于抗藥性雜草抗性機(jī)理的研究也成為熱點(diǎn)，但是目前有些雜草的抗草甘膦機(jī)制還并不明確。不僅如此，如表1所示，一些在世界范圍內(nèi)分布較廣的雜草，出現(xiàn)在多國(guó)產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象，如香絲草（Conyza bonariensis）、小白酒草、多花黑麥草、黑麥草（L．perenne）、硬直黑麥草等。

表1 抗草甘膦雜草分布及抗性機(jī)制

2 抗草甘膦雜草檢測(cè)方法研究現(xiàn)狀

2．1 整株水平測(cè)定

2．1．1 整株植物測(cè)定法

整株植物測(cè)定法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，是檢測(cè)雜草對(duì)除草劑是否產(chǎn)生抗性最為普遍的方法［16］。將疑似對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性的雜草種子盆栽，在溫室設(shè)置適宜雜草生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)。禾本科雜草一般培養(yǎng)到3葉期，闊葉及莎草科雜草根據(jù)雜草本身?xiàng)l件而定，培養(yǎng)到適合稱取生物量為宜。設(shè)置不同劑量處理雜草，草甘膦劑量不少于7個(gè)，2～3周后稱其鮮重、干重等指標(biāo)，運(yùn)用回歸模型計(jì)算出抗藥性水平［17］。整株植物法由于準(zhǔn)確度高而被廣泛用于檢測(cè)雜草對(duì)草甘膦抗藥性，目前發(fā)現(xiàn)的每種抗草甘膦雜草都用過此種方法，但此法需要較長(zhǎng)的時(shí)間，并要求足夠量的重復(fù)以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2．1．2 培養(yǎng)皿檢測(cè)法

培養(yǎng)皿法較整株植物測(cè)定法快速、簡(jiǎn)便。已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測(cè)雜草對(duì)除草劑的抗藥性［18－20］。在培養(yǎng)皿中加入濾紙，將不同濃度梯度草甘膦加入培養(yǎng)皿，草甘膦劑量一般設(shè)置6個(gè)，藥劑均勻浸濕濾紙，再將雜草種子放入培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d左右，通過測(cè)定發(fā)芽率、根長(zhǎng)等指標(biāo)，計(jì)算其抗性水平。Perez利用培養(yǎng)皿法成功檢測(cè)了智利果園多花黑麥草對(duì)草甘膦的抗藥性水平［14］。Leonardo也利用這種方法成功檢測(cè)出巴西的馬唐（Digitaria insul aris）對(duì)草甘膦產(chǎn)生了抗藥性［21］。

由于不同雜草的種子大小、發(fā)芽特性不同，該方法的應(yīng)用有一定局限性。一般應(yīng)用于禾本科雜草對(duì)除草劑的抗藥性檢測(cè)。培養(yǎng)皿法檢測(cè)抗藥性的準(zhǔn)確性較差，用此種方法測(cè)得的雜草對(duì)草甘膦的抗藥性水平一般高于整株植物法［22］。

2．1．3 癥狀指數(shù)法

草甘膦處理雜草后，會(huì)表現(xiàn)出褪色、黃化、葉片卷曲等癥狀，按照癥狀嚴(yán)重程度將其分為6個(gè)級(jí)別（表2）。將雜草種子盆栽培養(yǎng)到一定生長(zhǎng)階段，用不同濃度梯度草甘膦處理，當(dāng)不同處理雜草表現(xiàn)出的癥狀差異明顯時(shí)記錄其癥狀級(jí)別。利用曲線回歸模型計(jì)算GR50，確定雜草對(duì)草甘膦的抗性水平。吳加軍等用此方法測(cè)定了我國(guó)小白酒草對(duì)草甘膦的敏感程度［23］，重復(fù)性較好。癥狀指數(shù)法也有局限性，由于癥狀級(jí)別無明顯界限而且各種雜草受草甘膦處理后表現(xiàn)出的癥狀也有差別，因此劃分癥狀級(jí)別時(shí)有一定主觀性。

表2 雜草癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2．2 生物化學(xué)測(cè)定法

2．2．1 莽草酸法

草甘膦處理植株后，會(huì)引起敏感植株體內(nèi)莽草酸大量積累［9］，而耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物［24］與抗草甘膦雜草體內(nèi)莽草酸的積累量則明顯低于敏感植株［25］。Tor ben發(fā)現(xiàn)草甘膦處理的油菜體內(nèi)莽草酸的積累量與草甘膦劑量成正比關(guān)系，并用Logistic模型算出了草甘膦對(duì)油菜的GR50［26］。Dale也嘗試將不同劑量草甘膦處理雜草，從雜草葉片中檢測(cè)莽草酸含量，并算得幾種雜草對(duì)草甘膦的GR50［27］。莽草酸法在草甘膦噴藥后幾天便會(huì)檢測(cè)出結(jié)果，而且不需要大量的重復(fù)。Perez－Jones利用莽草酸法成功檢測(cè)出美國(guó)俄勒岡州抗草甘膦的多花黑麥草［28］。

2．2．2 其他檢測(cè)方法

5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶（EPSPS）是草甘膦的靶標(biāo)酶，硬直黑麥草等部分抗性雜草體內(nèi)EPSPS在草甘膦處理之后活性增高［29］，這種方法檢測(cè)草甘膦抗性較為快速，但需要精密的儀器，較多的費(fèi)用，因此不利于在抗性雜草發(fā)生地快速檢測(cè)，而且并不是所有的抗性雜草在草甘膦處理后EPSPS活性都增加，因此只適合于部分雜草的檢測(cè)。

檢測(cè)靶標(biāo)酶基因是否發(fā)生突變也可確認(rèn)雜草對(duì)草甘膦的抗性，基因突變使得EPSPS的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使其與底物的親和力增加，雜草因此形成對(duì)草甘膦的抗性［30］。由于不同抗性雜草EPSPS基因突變位點(diǎn)不同［31－32］，需要明確各種抗性雜草抗性突變位點(diǎn)才能充分利用分子生物學(xué)法檢測(cè)雜草對(duì)草甘膦的抗性。

3 結(jié)束語

耐草甘膦農(nóng)作物的發(fā)展增加了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，降低了管理成本，其發(fā)展勢(shì)頭強(qiáng)勁。但隨之帶來的抗性問題也需要引起重視。

值得注意的是，在已發(fā)現(xiàn)的抗草甘膦雜草中，馬唐、牛筋草是我國(guó)大豆等作物田常見雜草；小白酒草、香絲草、地膚（Kochia scoparia）等雜草在我國(guó)果園等分布廣泛。2006年，宋小玲等在我國(guó)浙江寧波發(fā)現(xiàn)抗草甘膦的小白酒草［33］。如果將來耐草甘膦農(nóng)作物在我國(guó)推廣，發(fā)展系統(tǒng)檢測(cè)抗草甘膦雜草的方法十分重要。

目前，我國(guó)關(guān)于草甘膦抗性雜草及其檢測(cè)方法的研究較少，正處于起步階段。培養(yǎng)皿法、癥狀指數(shù)法檢測(cè)雜草對(duì)草甘膦敏感性快速簡(jiǎn)便，但能否應(yīng)用于各種雜草也需要進(jìn)行深入研究。莽草酸法在檢測(cè)耐草甘膦作物如大豆、油菜對(duì)草甘膦敏感性上取得成功，但是莽草酸在各種雜草體內(nèi)的積累是否都與草甘膦劑量有正相關(guān)關(guān)系還沒有研究報(bào)道，因此這種方法對(duì)各種雜草抗性檢測(cè)的適用性還需進(jìn)一步研究。

有研究表明，草甘膦能對(duì)植物葉片葉綠素指數(shù)產(chǎn)生影響，而且與草甘膦劑量有一定關(guān)系［34］；植物體內(nèi)的一些物質(zhì)如苯丙氨酸解氨酶活性會(huì)因?yàn)椴莞熟⒌奶幚矶档停?5］。因此，也可以從這些方面進(jìn)行研究，發(fā)展完善抗草甘膦雜草的檢測(cè)方法。

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