2-甲氧基雌二醇對(duì)CEM細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究

張學(xué)亞，潘敬新，郭熙哲，戰(zhàn) 榕

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME2)是17β-雌二醇在體內(nèi)的生理代謝產(chǎn)物，由雌二醇2位碳原子先羥基化再甲基化而來(lái)，化學(xué)名為17β-2-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇［1］。具有選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞［2］，而對(duì)正常細(xì)胞毒性小［3］以及對(duì)雌激素受體α和β無(wú)依賴(lài)性［4］等特點(diǎn)，受到人們的廣泛關(guān)注。有研究表明［2］2-ME2在體外能夠抑制多種不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖，體內(nèi)動(dòng)物模型試驗(yàn)亦表明2-ME2具有明顯的抑制腫瘤增殖及減少腫瘤負(fù)荷的作用。但其確切作用機(jī)制尚不明確。本文選擇人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株CEM作為2-ME2體外研究模型，探討其對(duì)CEM細(xì)胞的抗腫瘤作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑:人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株CEM細(xì)胞(福建省血液病研究所細(xì)胞庫(kù));2-ME2購(gòu)自Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)溶解配成2 mmol·L-1原液，4℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋?zhuān)珼MSO終濃度＜0.1%。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品，Akt、p-Akt(ser473)兔多抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，β-actin鼠單抗為武漢博士德公司產(chǎn)品，蛋白酶抑制劑為上?？党缮锕こ逃邢薰井a(chǎn)品，化學(xué)發(fā)光底物試劑和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔抗體均購(gòu)自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 人急性淋巴細(xì)胞白血病CEM細(xì)胞株的培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇人急性淋巴細(xì)胞白血病CEM細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測(cè)2-ME2對(duì)CEM細(xì)胞增殖活性的影響 將CEM細(xì)胞(1×108·L-1)接種于96孔培養(yǎng)板中，經(jīng)不同濃度的2-ME2作用48 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入MTT(Amresco公司)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀(美國(guó)Stat公司，F(xiàn)ax-2100型)上用492 nm和630 nm雙波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖抑制率/%=(1-用藥組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%［6］。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)2-ME2對(duì)CEM細(xì)胞VEGF和hTERT mRNA表達(dá)的影響 收集2 μmol·L-12-ME2作用不同時(shí)間后的待測(cè)細(xì)胞，1/15 mmol·L-1PBS洗滌后，用TRIzol試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取各組細(xì)胞總RNA，操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的含量、純度及完整性。cDNA第1鏈的合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以βactin為內(nèi)參照，經(jīng)凝膠圖像分析儀(Gel Doc 1000型，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品)對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行半定量分析。所用引物序列應(yīng)用oligo軟件自行設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下:VEGF:上游引物序列，5′-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3′;下游引物序列，5′-CGATCGTTCTGTATCGTCTTTCC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 541 bp，退火溫度，64℃;hTERT:上游引物序列，5′-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′，下游引物序列，5′-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 145 bp，退火溫度，60℃;β-actin:上游引物序列，5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′，下游引物序列，5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為887 bp，退火溫度，56℃。PCR擴(kuò)增的有關(guān)參數(shù)如下:94℃變性5 min后進(jìn)入下列循環(huán):94℃變性30 s，最佳退火溫度40 s，72℃延伸共32個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min。制備含核酸燃料的1.5%瓊脂糖凝膠，取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物加適量溴酚藍(lán)點(diǎn)樣電泳10 min，經(jīng)凝膠圖像分析儀(Gel Doc 1000型，Bio-Rad)拍照并進(jìn)行半定量分析，以目的基因電泳條帶的熒光強(qiáng)度值與β-actin電泳條帶熒光強(qiáng)度值的比值表示相對(duì)表達(dá)水平［6］。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)2-ME2對(duì)CEM細(xì)胞Akt和p-Akt蛋白表達(dá)的影響 收集2 μmol·L-12-ME2作用不同時(shí)間后的待測(cè)細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌兩遍后，加入 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Pierce公司)細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，充分裂解后，低溫離心機(jī)12 000 r·min-1離心10 min，BCA 法(Pierce公司)定量蛋白濃度，取20 μg蛋白，加入上樣緩沖液，99℃變性5 min，10% ～15%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(GE公司)上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜后加相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，用化學(xué)發(fā)光底物試劑(Pierce公司)檢測(cè)分析［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。組間分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 2-ME2對(duì)CEM細(xì)胞增殖的影響 不同濃度2-ME2明顯抑制CEM細(xì)胞的增殖，隨著作用濃度增加，細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增高，抑制率50%時(shí)濃度為 2 μmol·L-1(Fig 1)。

2.2 2-ME2對(duì) CEM 細(xì)胞 VEGF和 hTERT mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)，2 μmol·L-1作用CEM細(xì)胞24 h后，hTERT mRNA表達(dá)水平即有減弱，并隨作用時(shí)間延長(zhǎng)趨勢(shì)越明顯，同時(shí)，VEGF mRNA表達(dá)水平隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱，作用72 h，已幾乎檢測(cè)不到VEGF mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，F(xiàn)ig 2)。

Fig 1 Effect of 2-ME2 on CEM cell proliferation at different concentrations at 48 h

Fig 2 Variation of hTERT，VEGF gene mRNA in CEM cells after treatment with 2 μmol·L －12-ME2*P＜0.05 vs control

2.3 2-ME2對(duì)CEM細(xì)胞 Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響 2-ME2處理CEM細(xì)胞24 h后，p-Akt蛋白表達(dá)水平急劇下降，作用48 h后達(dá)到最低。而總Akt蛋白表達(dá)水平則無(wú)變化。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，F(xiàn)ig 3)。

3 討論

白血病是一組異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，造血干/祖細(xì)胞在分化過(guò)程的不同階段發(fā)生惡性增殖是其重要致癌機(jī)制之一。其中端粒酶活性增強(qiáng)及異?；钴S的腫瘤血管新生可導(dǎo)致白血病細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而誘發(fā)白血病發(fā)生。因此，抑制白血病細(xì)胞端粒酶活性和血管新生已成為造血系統(tǒng)惡性腫瘤治療的新策略［7-8］。其中，hTERT是維持端粒酶活性最重要的成分，hTERT與端粒酶活性呈平行相關(guān)，hTERT活性表達(dá)被認(rèn)為是端粒酶激活的限速步驟［9-10］。章堯等［11］研究報(bào)道三氧化二砷體外能夠有效抑制HL-60增殖，這與下調(diào)hTERT mRNA表達(dá)相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)不同濃度2-ME2能夠抑制白血病細(xì)胞株CEM的增殖，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為2 μmol·L-1。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，2-ME2抑制CEM細(xì)胞增殖的過(guò)程中，hTERT mRNA表達(dá)水平隨著細(xì)胞增殖抑制程度的升高而逐漸下降。提示下調(diào)hTERT mRNA表達(dá)參與了2-ME2抑制CEM細(xì)胞增殖的過(guò)程。

Fig 3 Variation of Akt，p-Akt in CEM cells after treatment with 2 μmol·L －12-ME2*P＜0.05 vs control

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前活性最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子，VEGF不僅對(duì)實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生明顯影響，而且在多數(shù)造血系統(tǒng)惡性腫瘤中也起重要作用［12］，VEGF在白血病發(fā)生中的作用還不夠明確，很可能VEGF通過(guò)結(jié)合其相應(yīng)的受體，進(jìn)一步使Akt磷酸化促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的生存與增殖［11］。Akt是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，它與人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，有資料顯示［13-14］在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Akt活性增高，是抗腫瘤藥物治療的有效作用靶點(diǎn)。因此，通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)而干擾PI3K/Akt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，成為一種新的藥物抗腫瘤機(jī)制。我們的結(jié)果顯示2-ME2作用CEM細(xì)胞24 h后，VEGF mRNA表達(dá)即有明顯降低，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，同時(shí)，p-Akt的表達(dá)24 h呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)，48 h達(dá)到最高抑制效應(yīng)，而總Akt蛋白表達(dá)水平則無(wú)變化。這表明2-ME2可以通過(guò)抑制VEGF表達(dá)而阻斷Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)從而達(dá)到抑制CEM細(xì)胞增殖的作用。由于Akt信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，2-ME2干擾該通路轉(zhuǎn)導(dǎo)是否還存在其他因素，還有待于進(jìn)一步研究。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)2-ME2體外能夠有效抑制CEM細(xì)胞增殖，降低hTERT mRNA表達(dá)和部分通過(guò)降低VEGF mRNA表達(dá)而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。

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