NAC拮抗As2O3對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的毒性作用

李彩麗，魏虎來，蘇海翔

砷化合物是一種具有毒性的物質(zhì)，易與體內(nèi)含巰基的酶結(jié)合而抑制酶活性，可與DNA聚合酶結(jié)合，影響DNA合成、修復(fù)，誘導(dǎo)染色體畸變和DNA損傷。同時(shí)砷也是人體必需的微量元素之一，適量的砷能剌激機(jī)體造血和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等［1］，但過量攝入會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生免疫抑制等毒性作用［2］。As2O3作為一種有效的抗腫瘤藥物已廣泛應(yīng)用于白血病和實(shí)體瘤的治療中，研究證實(shí)［3－4］As2O3可誘導(dǎo)耐藥白血病細(xì)胞凋亡。我們的前期研究證實(shí)［5］As2O3對(duì)外周血淋巴細(xì)胞具有毒性效應(yīng)，機(jī)制可能與其抑制Bcl-2表達(dá)有關(guān)。本研究進(jìn)一步觀察As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的毒性作用以及N-乙酰-L-半胱氨酸(N acetylcysteine，NAC)的拮抗保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑 As2O3為 Sigma公司產(chǎn)品，配成 10 mmol·L－1貯備液;NAC購(gòu)于上海源聚生物科技有限公司，用生理鹽水配成2 mol·L－1的貯存液;淋巴細(xì)胞分離液(上海第三生化試劑廠);碘化丙錠(Propidium iodide，PI)、DCF-DA 和 RPMI 1640為 Sigma公司產(chǎn)品;新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所;異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記鼠抗人Bcl-2單抗和鼠IgG1為美國(guó)Caltag實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品;FITC-Annexin V/PI試劑盒購(gòu)自Biovision公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血淋巴細(xì)胞分離 抽取健康人外周血10 ml，肝素抗凝。加入等量淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypague，d=1.077g·ml－1)，室溫、1 500 r·min－1離心30 min，吸取中間界面層淋巴細(xì)胞。用RPMI 1640洗滌2次，用1%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于95%。

1.2.2 人外周血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng) 正常人外周血淋巴細(xì)胞用含15%新生牛血清、1×105U·L－1青霉素和鏈霉素的RPMI 1640稀釋成3×108·L－1后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)中，分別加入1 ～50 μmol·L－1As2O3、2 mmol·L－1NAC 和1 ～50 μmol·L－1As2O3+2 mmol·L－1NAC，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 Annexin-V/PI 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按文獻(xiàn)［6］的方法收集不同濃度As2O3和(或)2mmol·L－1NAC作用48 h后的淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×109·L－1，PBS 洗滌，用 500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，避光室溫放置5 min，流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

Tab 1Effect of arsenic trioxide and/or NAC on proliferation of lymphocytes(±s，n=4)

Tab 1Effect of arsenic trioxide and/or NAC on proliferation of lymphocytes(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs As2O3

Concentration As2O3/mmol·L －1 Inhibition rate/%24 h Without NAC added With NAC added 48 h Without NAC added With NAC added 72 h Without NAC added With NAC added 0 2.4 ±0.2 2.1 ±0.3 4.1 ±0.67 3.6 ±0.81 8.2 ±0.1.20 7.5 ±1.50 5 37.8 ±4.86 16.3 ±2.23＊＊ 45.1 ±5.26 24.6 ±3.58＊＊ 56.4 ±5.30 34.6 ±7.15*10 51.5 ±7.13 24.2 ±3.75＊＊ 64.0 ±6.53 37.7 ±4.24＊＊ 77.2 ±6.08 42.1 ±6.39＊＊20 70.0 ±8.72 35.9 ±5.61＊＊ 83.6 ±7.11 43.3 ±6.36＊＊ 90.2 ±5.57 48.0 ±9.88＊＊

1.2.4 電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 收集經(jīng)As2O3單獨(dú)及與NAC聯(lián)合處理的細(xì)胞，按文獻(xiàn)［7］方法常規(guī)固定和包埋，在透射電鏡(JEM 1230，日本電子公司)下觀察淋巴細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［8］。分別收集As2O3單獨(dú)及與NAC聯(lián)合作用12 h和24 h后的淋巴細(xì)胞1×109·L－1，PBS洗滌。細(xì)胞重懸于1 ml PBS中，加入10 mmol·L－1DCF-DA使其終濃度達(dá) 100 μmol·L－1，37℃孵育 1 h 后 FCM 檢測(cè)。

1.2.6 Bcl-2蛋白表達(dá)水平測(cè)定 參照文獻(xiàn)［9］。分別收集As2O3單獨(dú)及與NAC聯(lián)合作用48 h后的外周血淋巴細(xì)胞1×109·L－1，PBS洗滌。分別加入細(xì)胞固定劑和通透劑，再加入FITC標(biāo)記的鼠抗人Bcl-2單抗染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠IgG1同型抗體為對(duì)照，F(xiàn)CM檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率和平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 NAC對(duì)As2O3抑制外周血淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的拮抗作用 不同濃度的As2O3對(duì)正常人外周血淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制效應(yīng)，并呈現(xiàn)明顯的濃度與時(shí)間依賴關(guān)系。而2 mmol·L－1NAC與5～20 μmol·L－1的 As2O3聯(lián)合作用 24、48 和 72 h，可拮抗As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的毒性作用，尤以24 h的保護(hù)效應(yīng)最為明顯(Tab 1，P ＜0.05～0.01)。

2.2 NAC拮抗As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

2.2.1 Annexin-V/PI雙標(biāo)記染色 FITC-Annexin V/PI雙標(biāo)記染色法檢測(cè)表明5.0 μmol·L－1As2O3作用于淋巴細(xì)胞48h后，總凋亡率達(dá)89.2%，比對(duì)照組提高了 56 倍。2 mmol·L－1NAC 與 5 μmol·L－1As2O3聯(lián)合作用后，存活細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞總凋亡率較As2O3單獨(dú)作用降低了22%(Fig 1)。

Fig 1 The antagonism of NAC on apoptosis of lymphocytes induced by arsenic trioxideA:Control;B:2 mmol·L －1NAC;C:5 μmol·L －1As2O3;D:2 mmol·L －1NAC+5 μmol·L －1As2O3

2.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 電鏡觀察，外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)不同濃度的As2O3處理后，凋亡及死亡細(xì)胞多見，細(xì)胞呈現(xiàn)體積縮小、胞質(zhì)濃縮、染色體聚集、固縮、沿核膜內(nèi)側(cè)分布等較為典型的凋亡細(xì)胞特征性形態(tài)改變。而采用NAC拮抗后，死亡細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變不明顯(Fig 2)。

2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的變化 As2O3可增高淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P＜0.01)，NAC則降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。而NAC與As2O3聯(lián)合作用，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較As2O3單獨(dú)作用明顯降低(P＜0.01)，2 mmol·L－1NAC+5 μmol·L－1As2O3聯(lián)合作用12 h和24 h分別降低37.4%和39.4%，而2 mmol·L－1NAC+10 μmol·L－1As2O3聯(lián)合作用12 h和24 h則分別降低33.3%和39.1%(Fig 3)。

2.4 細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的改變 As2O3明顯降低淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，而NAC與As2O3聯(lián)合則可拮抗As2O3所致淋巴細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的降低，其中2 mmol·L－1NAC 與5 μmol·L－1As2O3聯(lián)合作用48 h較 5 μmol·L－1As2O3單獨(dú)作用增高15.2%(Fig 4)。

Fig 2 Morphologic change of lymphocytes after administration of NAC or/and arsenic trioxide(×15 000)

Fig 3 Effect of NAC and/or arsenic trioxide on ROS level in lymphocytes±s，n=4)A:5 μmol·L －1As2O3;B:10 μmol·L －1As2O3;C:2 mmol·L －1NAC;D:2 mmol·L －1NAC+5 μmol·L －1As2O3;E:2 mmol·L－1NAC+10 μmol·L－1As2O3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs A;△△P＜0.01 vs B

3 討論

As2O3是目前臨床有效的抗腫瘤藥物，在白血病和實(shí)體瘤治療中得到廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)［2］砷在體內(nèi)外對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)均有較明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們的前期研究結(jié)果［5］證實(shí)，As2O3在體外能明顯抑制外周血淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，且抑制程度呈劑量依賴關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)As2O3誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的同時(shí)，增高淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS水平和降低細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。

ROS是真核細(xì)胞有氧呼吸時(shí)的產(chǎn)物，在細(xì)胞凋亡的過程中扮演著重要角色。ROS可降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化物的有效性而使細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)失衡，并可直接或間接改變線粒體膜電位等，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。Bcl-2位于線粒體、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的主要蛋白，主要通過減少氧自由基的產(chǎn)生，穩(wěn)定線粒體膜，阻斷Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖［11］。NAC作為一種抗氧化劑和自由基清除劑，能夠減輕藥物或毒物對(duì)DNA的損傷，拮抗細(xì)胞毒物質(zhì)所致的細(xì)胞凋亡［12］。本研究中NAC可降低淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS和促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá);NAC與As2O3聯(lián)合應(yīng)用，可拮抗As2O3所致淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS的增加和Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制，保護(hù)或減輕As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。綜上所述，As2O3主要通過誘導(dǎo)凋亡途徑對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，機(jī)制可能與其增高細(xì)胞內(nèi)ROS水平和抑制Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān);NAC可通過清除細(xì)胞內(nèi)ROS和促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)而拮抗As2O3對(duì)淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

Fig 4 Expression of Bcl-2 in lymphocytes after treatment of NAC and/or arsenic trioxideA:Control;B:2 mmol·L －1NAC;C:5 μmol·L －1As2O3;D:2 mmol·L －1NAC+5 μmol·L －1As2O3

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