漆樹黃酮逆轉(zhuǎn)人肝癌細胞HepG2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗研究

李 蓉，黎小兵，敬 敏，陳 錦，黃培春

漆樹黃酮(Fisetin)，3，3′，4′，7-四羥基黃酮是廣泛存在于水果和蔬菜中的一種多酚化合物，具有抗氧化［1］、抗炎［2］等作用?？鼓[瘤作用也是其重要藥理作用之一，越來越多的細胞實驗和動物實驗顯示漆樹黃酮有抑制前列腺癌PC3和LNCaP細胞［3-4］、胰腺癌 AsPC-1 細胞［5］、肺癌 A549 細胞［6］、結(jié)腸癌HT-29細胞［7］的增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲以及化療、放療增敏的作用。我們前期的實驗已證實漆樹黃酮具有抑制人肝癌細胞HepG2增殖、誘導凋亡及增強化療藥物敏感性的作用。本文用體外實驗的方法研究漆樹黃酮對人肝癌細胞HepG2侵襲、運動能力和上皮標志物上皮性鈣粘附蛋白(E-cadherin)、間質(zhì)標志物波形蛋白(vimentin)、p38MAPK的影響，探討漆樹黃酮逆轉(zhuǎn)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及機制，分析其抗腫瘤侵襲運動的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌細胞株HepG2由廣東省天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室中心提供。細胞在含10%小牛血清、青霉素1×105U·L-1、鏈霉素100 mg·L-1的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 超級小牛血清購自杭州四季青公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco產(chǎn)品;纖維粘連蛋白(FN)及重組Matrigel購自BD公司;Transwell小室(直徑6.5 mm，孔徑8.0 μm)購自Sigma公司;漆樹黃酮購自Sigma公司，實驗前漆樹黃酮用DMSO溶解，培養(yǎng)液稀釋DMSO，終濃度≤0.1%，該濃度對細胞無影響。RT-PCR試劑盒(寶生物工程有限公司);PCR引物(由上海生工合成);兔抗人p38MAPK多克隆抗體、鼠抗人E-cadherin購自北京中杉金橋公司，鼠抗人vimentin購自北京博奧森公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 MTT法測定HepG2細胞增殖抑制作用 選取HepG2細胞配制成8×103/孔，接種到96孔中，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，加入漆樹黃酮，使其終濃度分別為 0(對照組)、50、100、200 μmol·L-1，設 4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT 20 μl(5 g·L-1)4 h。棄上清液，加入200 μl DMSO，震蕩溶解。酶標儀測A570。增殖抑制率(IR/%)=［(對照組A570-實驗組A570)/對照組A570］×100%。同時相差顯微鏡觀察各濃度組HepG2細胞形態(tài)。

1.4 重組基底膜侵襲、趨化性運動實驗 在Transwell小室膜的內(nèi)表面涂基膜成分Matrigel 10 μg(50 μl)，超凈臺通風過夜使之干燥，形成人工重組基膜;在24孔培養(yǎng)板孔中加人含有10 mg·L-1纖維黏連蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)基600 μl。收集對數(shù)生長期的細胞HepG2細胞，分別用加不同濃度漆樹黃酮(同“1.3”)和未加漆樹黃酮的含1%BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整濃度為1×109·L-1。將Transwell小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中，每個小室加細胞懸液100 μl，置孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棉簽小心擦去未穿膜的細胞，干燥后中性樹膠封片，于400倍顯微鏡下計數(shù)穿過濾膜的細胞數(shù)。每膜計數(shù)上下左右中5個隨機不同視野。每組平行設3個濾膜。按照如下公式計算侵襲抑制率。侵襲抑制率(IR/%)=［(對照組穿膜細胞數(shù)-實驗組穿膜細胞數(shù))/對照組穿膜細胞數(shù)］×100%。

運動實驗與侵襲實驗相比，只是PVPF濾膜上不需鋪Matrigel。運動抑制率(IR/%)=［(對照組穿膜細胞數(shù)-實驗組穿膜細胞數(shù))/對照組穿膜細胞數(shù)］×100%。

1.5 RT-PCR檢測p38MAPK、E-cadherin和 vimentin mRNA表達 加入漆樹黃酮后HepG2各組(分組方法同“1.3”)細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用TRIzol等試劑提取細胞的總RNA。核酸蛋白定量儀測定RNA的含量和純度，取A260/A280＞1.8的樣品用于RT-PCR實驗。應用Primer Premier5.0軟件和Web Primer 3軟件進行引物設計。p38MAPK上游引物序列 5′-GGGGCACATCTGAACAACAT-3′，下游引物 5′-GCAAAGTAGGCATGTGCAAG-3′，擴增產(chǎn)物大小為599 bp。E-cadherin上游引物序列5′-AGT GAC GAA TGT GGT ACC TTT TGA-3′，下游引物 5′-TGAAGGGAGATGTTTGGGGAGGAAGGTC-3′，擴 增產(chǎn)物大小為507 bp。vimentin上游引物序列5′-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3′，下 游 引 物 5′-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3′，擴增產(chǎn)物大小為 750 bp，GAPDH 上游引物序列 5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′， 下 游 引 物 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′，擴增產(chǎn)物為231 bp。擴增條件50℃30 min，94℃ 3 min，94℃ 45 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共31個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取擴增產(chǎn)物5 μl用2.0%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含EB染料)電泳。紫外燈下觀察并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.6 Western blot檢測 p38MAPK、E-cadherin、vimentin的表達 細胞分組同“1.3”，取1×106個細胞以細胞裂解液裂解，沸水變性5 min，15 000 r·min-14℃離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，取100 μg蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳。濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜與兔抗人p38MAPK、鼠抗人E-cadherin及鼠抗人vimentin(1∶400)4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG室溫孵育2 h，ECL檢測，β-actin作為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件的均數(shù)比較及單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 漆樹黃酮對HepG2細胞增殖抑制作用和形態(tài)學變化 漆樹黃酮作用HepG2細胞24 h后的抑制率分別為(19.52±5.07)%、(27.54±4.11)%、(35.33 ±3.62)%(P ＜0.01)，IC50為244.52 μmol·L-1，在低于 250 μmol·L-1濃度下無明顯的細胞毒作用，故選擇的 50、100、200 μmol·L-1漆樹黃酮作為體外侵襲、運動的實驗濃度。不同濃度漆樹黃酮(50、100、200 μmol·L-1)處理 24 h 后細胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變(Fig 1):空白對照組細胞呈梭形生長，細胞數(shù)增多。50 μmol·L-1組細胞連接較為松散，很多脫落變圓細胞，分散，少有連成一片，類成纖維樣細胞數(shù)量減少;隨著漆樹黃酮濃度增高細胞的抑制作用明顯，細胞變圓，黏附性降低，漂浮于培養(yǎng)液中。

Fig 1 the morphologic changes in HepG2 cells treated by fisetin(400×)A:Control group;B:50 μmol· L-1fisetin group;C:100 μmol·L-1fisetin group;D:200 μmol·L-1fisetin group

2.2 漆樹黃酮對HepG2細胞侵襲基底膜成分能力的影響 用50、100、200 μmol·L-1的漆樹黃酮處理細胞HepG2 24 h后，細胞侵襲基底膜成分能力明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其抑制率分別是39.76%、51.17%、56.80%。見Fig 2。

2.3 漆樹黃酮對HepG2細胞體外趨化運動能力的影響 用50、100、200 μmol·L-1的漆樹黃酮處理細胞HepG2 24 h后，細胞體外趨化運動能力明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其抑制率分別是 35.57%、44.10%、46.86%。見Fig 3。

2.4 漆樹黃酮對p38MAPK、E-cadherin和vimentin mRNA表達影響 如Fig 4所示，當漆樹黃酮作用濃度增大時，HepG2細胞各組p38MAPK mRNA表達擴增條帶減弱，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);vimentin RNA表達擴增條帶減弱，其中當漆樹黃酮的濃度為100 μmol·L-1，vimentin mRNA表達明顯減弱，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);E-cadherin mRNA表達擴增條帶沒有表達。

Fig 2 The effect of invasion in HepG2 cells treated by fisetin(400×)A:Control group;B:50 μmol· L-1fisetin group;C:100 μmol·L-1fisetin group;D:200 μmol·L-1fisetin group

Fig 3 The effect of migration in HepG2 cells treated by fisetin(400×)A:Control group;B:50 μmol· L-1fisetin group;C:100 μmol·L-1fisetin group;D:200 μmol·L-1fisetin group

2.5 漆樹黃酮對p38MAPK、E-cadherin和vimentin蛋白表達影響 如Fig 5所示，當漆樹黃酮作用濃度增大時HepG2細胞各組p38MAPK蛋白表達減弱，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);vimentin蛋白表達減弱，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);E-cadherin蛋白沒有表達。

3 討論

Fig 4 The mRNA expression of E-cadherin，vimentin and p38MAPK in HepG2 cells treated by fisetin1:Control group;2:50 μmol·L-1fisetin group;3:100 μmol·L-1fisetin group;4:200 μmol·L-1fisetin group

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞獲得了成纖維細胞樣表型，表現(xiàn)為上皮細胞標志物(E-cadherin/catenins復合體等)表達下調(diào)、伴隨間葉細胞標志物(N-cadherin，vimentin，fibronectin等)出現(xiàn)、原有的細胞外基質(zhì)降解、形成新的細胞-基質(zhì)黏附等，其結(jié)果是細胞間黏附減弱、細胞運動能力大大增強。上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化是胚胎發(fā)育過程中的生理現(xiàn)象，但近年來發(fā)現(xiàn)部分上皮細胞來源的惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中會出現(xiàn)“返祖現(xiàn)象”，與腫瘤細胞的浸潤和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8-9］。本實驗結(jié)果顯示人肝癌細胞系HepG2細胞上皮間質(zhì)標志物E-cadherin表達缺失，vimentin表達陽性，HepG2細胞呈梭形。HepG2細胞發(fā)生EMT;HepG2細胞能降解基底膜，具有轉(zhuǎn)移侵襲能力。如果用漆樹黃酮針對這一環(huán)節(jié)進行藥物干預，觀察漆樹黃酮能否能通過逆轉(zhuǎn)EMT，從而降低轉(zhuǎn)移侵襲潛能，為開發(fā)漆樹黃酮的藥理作用奠定一定的基礎。本研究發(fā)現(xiàn)，漆樹黃酮抑制分子間質(zhì)標志物vimentin表達，上皮標志物 E-cadherin表達沒有增強。形態(tài)學方面表現(xiàn)為用藥后HepG2細胞連接較為松散，很多細胞脫落變圓，分散、少有連成一片，類成纖維樣細胞數(shù)量減少，同時運動侵襲試驗顯示漆樹黃酮能降低HepG2細胞侵襲和運動能力。說明漆樹黃酮能引起能逆轉(zhuǎn)HepG2細胞EMT，降低HepG2細胞轉(zhuǎn)移潛能。

Fig 5 The protein expression of E-cadherin，vimentin and p38MAPK in HepG2 cells treated by fisetin1:Control group;2:50 μmol·L-1fisetin group;3:100 μmol·L-1 fisetin group;4:200 μmol·L-1fisetin group

p38MAPK自1993年被Brewster等首先發(fā)現(xiàn)以來逐步成為生物學研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)［10］p38MAPK是原腸胚形成過程中E-cadherin的負調(diào)控因子。表明p38MAPK也是一重要的EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育的某些過程中，肩負著引發(fā)細胞移動以及組織重組的任務。而類似的細胞移動以及組織重塑情形在腫瘤轉(zhuǎn)移的時候也會發(fā)生。實驗發(fā)現(xiàn)漆樹黃酮抑制p38MAPK并沒有提高E-cadherin的表達，而是抑制vimentin表達，來逆轉(zhuǎn)HepG2細胞EMT，降低HepG2細胞轉(zhuǎn)移潛能。p38MAPK逆轉(zhuǎn)EMT的機制有待進一步深入研究。

［1］Hanneken A，Lin F F，Johnson J.et al.Flavonoids protect human retinal pigment epithelial cells from oxidative-stress-induced death［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(7):3164-77.

［2］Higa S，Hirano T，Kotani M，et al.Fisetin，a flavonol，inhibits TH2-type cytokine production by activated human basophils［J］.J Allergy Clin Immunol，2003，111(6):1299-306.

［3］Khan N，Afaq F，Syed D N，et al.Fisetin，a novel dietary flavonoid，causes apoptosis and cell cycle arrest in human prostate cancer LNCaP cells［J］.Carcinogenesis，2008，29(5):1049-56.

［4］Haddad A Q，F(xiàn)leshner N，Nelson C，et al.Antiproliferative mechanisms of the flavonoids 2，2′-dihydroxychalcone and fisetin in human prostate cancer cells［J］.Nutr Cancer，2010，62(5):668-81.

［5］Murtaza I，Adhami V M，Hafeez BB，et al.Fisetin，a natural flavonoid，targets chemoresistant human pancreatic cancer AsPC-1 cells through DR3-mediated inhibition of NF-κB［J］.Int J Cancer，2009，125(10):2465-73.

［6］Liao Y C，Shih Y W，Chao C H，et al.Involvement of the ERK signaling pathway in fisetin reduces invasion and migration in the human lung cancer cell line A549［J］.J Agric Food Chem，2009，57(19):8933-41

［7］Chen W S，Lee Y J，Yu Y C，et al.Enhancement of p53-mutant human colorectal cancer cells radiosensitivity by flavonoid fisetin［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2010，77(5):1527-35.

［8］Geiger T R，Peeper D S.Metastasis mechanisms［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1796(2):293-308.

［9］徐思云，李 靜，耿美玉.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的信號轉(zhuǎn)導調(diào)控及藥物開發(fā)［J］.中國藥理學通報，2008，24(9):1131-4.

［9］Xu S Y，Li J，Geng M Y.The signal transduction and drug development of epithelial-mesenchymal transition［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(9):1131-4.

［10］Zohn I E，Li Y，Skolnik E Y，et al.p38 and a p38-interacting protein are critical for downregulation of E-cadherin during mouse gastrulation［J］.Cell，2006，125(5):957-69.