銀杏內(nèi)酯B對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

劉熹昀，趙革新，鮑 利，陳北冬，吳 偉，齊若梅

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病致死的主要病理改變，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，炎癥細(xì)胞以及血小板。近年研究顯示［1－3］血小板不僅參與動脈粥樣硬化晚期的血栓形成，在動脈粥樣硬化早期階段通過釋放炎癥介質(zhì)促進(jìn)動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)是中藥銀杏葉提取物，早期研究顯示GB能夠特異性拮抗血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)受體，從而抑制血小板聚集、釋放等功能［4］。本研究觀察了GB是否能夠減少血小板炎癥介質(zhì)釋放，從而抑制ApoE－/－小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)展，以及 GB對ApoE－/－小鼠血漿 RANTES(regulated on activation，normal T-cell expressed and secreted)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 銀杏內(nèi)酯B購自江蘇大觀園商貿(mào)公司，純度為95%(批號:BAT2007115)。高脂飼料購自北京科澳協(xié)力有限公司，含脂肪15%，膽固醇1.25%。RANTES ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。HE染色液購自北京試劑合力生物科技公司。油紅O和OCT購自Sigma公司。Mac-3抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 實驗動物 24只8周齡♂ ApoE－/－小鼠和12只C57BL/6J小鼠購自北京大學(xué)實驗動物中心［合格證號:SCXK(京)2006-0008］。ApoE－/－小鼠分為兩組，模型組和GB藥物組，每組12只，均給予高脂飲食，GB組每日灌胃給藥0.6 mg，模型組以等體積的PBS的每日灌胃。C57BL/6J小鼠為正常組，以普通飲食喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后處死，處死前禁食12 h，不禁水。

1.3 小鼠主動脈弓及胸主動脈油紅O染色 實驗小鼠被處死后從左心室緩慢灌流PBS，然后分離主動脈弓和胸主動脈，縱向剖開管腔后進(jìn)行油紅O染色。

1.4 小鼠主動脈弓及胸主動脈掃描電鏡觀察 實驗小鼠被處死后從左心室緩慢灌流PBS，再用戊二醛體內(nèi)固定，分離出主動脈弓及胸主動脈，縱向切開后體外固定、脫水、干燥。使用FEG場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡(型號為FEI QUANTA 200)下觀察血管內(nèi)成像。

1.5 血管HE染色及巨噬細(xì)胞免疫組化染色 實驗小鼠處死后從左心室灌流PBS，分離主動脈頭臂干部分，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片。用HE染色觀察動脈斑塊，用抗巨噬細(xì)胞抗體Mac3免疫組化染色觀察巨噬細(xì)胞浸潤。

1.6 血漿RANTES測定 用戊巴比妥麻醉小鼠，眼眶后取血，體積分?jǐn)?shù)為3.8%枸櫞酸鈉抗凝，1 000 r·min－1離心 20 min，取上清后再次 10 000 r·min－1離心10 min，以完全去除血細(xì)胞。使用 R＆D公司ELISA試劑盒進(jìn)行RANTES測定，測定方法按照試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡 電鏡觀察 C57BL/6J小鼠主動脈內(nèi)壁表面光滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列規(guī)則，縱嵴方向整齊。模型組ApoE－/－小鼠血管內(nèi)可見碩大斑塊及壞死組織，斑塊周圍內(nèi)膜病變明顯，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜破損等改變;GB處理的ApoE－/－小鼠血管內(nèi)斑塊較小，斑塊周邊主動脈內(nèi)膜病變較輕(Fig 1)。

Fig 1 Effect of GB on the atherosclerosis in C57BL/6J and ApoE －/－ mice showed by scanning electron microscopic imagesA:Aorta of C57BL/6J mice with normal diet;B:Aorta of ApoE－/－ mice with high-fat diet;C:Aorta of ApoE－/－ mice with highfat diet and GB.

2.2 主動脈HE染色 主動脈頭臂干部位是最容易發(fā)生動脈粥樣硬化的部位。正常組C57BL/6J小鼠的主動脈腔內(nèi)未見粥樣斑塊;模型組ApoE－/－小鼠主動脈頭臂干部位形成較大的粥樣斑塊，面積約占管腔面積3/5，GB組ApoE－/－小鼠頭臂動脈管腔斑塊面積明顯減小(Fig 2)。

Fig 2 HE staining(hematoxylin-eosin)of atherosclerotic plaque in C57BL/6J and ApoE －/－ mice.Note see Fig 1

Tab 1 Plasma level of RANTES by ELISA( ± s，n=12)

Tab 1 Plasma level of RANTES by ELISA( ± s，n=12)

＊＊P＜0.01 vs normal group;△△P＜0.01 vs model group

Group RANTES/ng·L －1 Normal(C57BL/6J)123.81 ±12.74 Model(ApoE－/－)359.16 ±12.79＊＊GB(ApoE －/－)193.32 ±51.45＊＊△△

2.3 油紅O染色 油紅O能特異地結(jié)合脂質(zhì)形成肉眼可見的紅色。各組主動脈頭臂干部位的油紅O染色結(jié)果顯示，C57BL/6J小鼠管腔內(nèi)僅在分支處有少量脂質(zhì)沉積;模型組ApoE－/－小鼠主動脈弓管腔內(nèi)可見大量脂質(zhì)沉積，尤其在血管分叉處脂質(zhì)沉積十分明顯;GB組ApoE－/－小鼠脂質(zhì)沉積斑塊明顯減少(Fig 3)。

Fig 3 Oil Red O staining of atherosclerotic plaque in C57BL/6J and ApoE －/－ mice.Note see Fig 1

2.4 巨噬細(xì)胞免疫組化染色 用Mac-3抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞，經(jīng)過與辣根過氧化氫酶標(biāo)記的二抗IgG結(jié)合顯色后呈褐色。結(jié)果顯示正常組C57BL/6J小鼠的主動脈未見巨噬細(xì)胞沉積。對照組ApoE－/－小鼠動脈粥樣斑塊處可見大量巨噬細(xì)胞沉積，斑塊中間部位也可見到巨噬細(xì)胞沉積，而GB組ApoE－/－小鼠巨噬細(xì)胞主要聚集在斑塊的表面部位(Fig 4)。

Fig 4 Immunohistochemical staining of macrophage in atherosclerotic plaque in C57BL/6J and ApoE －/－ mice.Note see Fig 1.

2.5 血漿 RANTES測定 ELISA法測定血漿RANTES，顯示 C57BL/6J組小鼠 RANTES含量為123.81 ng·L－1，模型組 ApoE－/－小鼠 RANTES 含量明顯升高，為359.06 ng·L－1，而GB處理的Apo E－/－小鼠 RANTES 為 193.62 ng·L－1。各組之間比較差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

近年研究顯示［5－6］血小板在動脈粥樣硬化的炎癥過程中起十分重要的作用。血小板細(xì)胞內(nèi)儲存著大量的炎癥蛋白，一旦血小板發(fā)生活化，這些炎癥介質(zhì)便會釋放，參與炎癥反應(yīng)。血小板活化因子具有多種生物活性作用，參與炎癥、變態(tài)反應(yīng)、調(diào)解中性粒細(xì)胞功能等［7］。研究顯示［8］，GB 對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激的炎癥蛋白ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)表達(dá)也有較好的抑制作用。黃賤英等［9］最近報道了GB對缺血/再灌注大腦損傷有保護(hù)作用。這些研究均表明GB是一個多靶點藥物，對心腦血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。根據(jù)這些研究，我們推測GB能夠通過抑制血小板活化，減少血小板釋放反應(yīng)抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)展。我們先前使用GB抑制血小板功能的體外研究結(jié)果顯示［10］，GB 400 和800 mg·L－1能夠有效抑制血小板聚集。根據(jù)這一結(jié)果以及參考動物實驗的給藥方法，本研究GB 0.6 mg每日給藥，實驗過程中未發(fā)現(xiàn)動物有出血傾向。

ApoE是一個載脂蛋白，ApoE基因變異以及基因敲除能夠誘發(fā)血脂運輸、代謝異常，導(dǎo)致動脈粥樣硬化。因此，本研究使用ApoE基因敲除小鼠制備動脈粥樣硬化模型，觀察銀杏內(nèi)酯B對動脈粥樣硬化進(jìn)展的影響。本研究對各組動物模型血管切片電鏡以及HE染色結(jié)果均顯示，模型組ApoE－/－小鼠粥樣斑塊中含有較多的空泡區(qū)，表明有大量壞死成分。與此相比較，GB處理的ApoE－/－基因敲除小鼠斑塊較小，血管壁平滑肌層有明顯增生，這些特征表明給予GB藥物干預(yù)后使血管病變減緩，處于斑塊形成的相對早期階段。巨噬細(xì)胞染色的結(jié)果顯示，GB處理組小鼠動脈粥樣局部表面巨噬細(xì)胞沉積較多，與大多數(shù)研究報告的動脈粥樣硬化早期炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象是相符合的。

RANTES是機體內(nèi)參與炎癥反應(yīng)的主要炎癥介質(zhì)，具有化學(xué)趨化作用，存在于血小板、平滑肌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，但血小板是其主要來源之一［11］。一些研究顯示動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)RANTES在斑塊局部沉積，表明RANTES直接參與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)［12－13］。Schober等［14］報道了使用 RANTES抑制劑能夠減輕電損傷導(dǎo)致的血管內(nèi)膜新生以及巨噬細(xì)胞浸潤，從而減輕動物頸動脈斑塊，并證實RANTES對血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥影響與血小板表達(dá)的P選擇素增加相關(guān)聯(lián)。本研究分析了GB對各組小鼠血漿RANTES含量的影響。模型組ApoE－/－小鼠和GB處理的ApoE－/－小鼠血漿RANTES均較陰性對照組(C57BL/6J)明顯增高，其中，陽性對照ApoE－/－小鼠的RANTES含量比陰性對照組高2.9倍。GB處理的ApoE－/－小鼠的RANTES含量較模型組降低了1.85倍，但與陰性對照組比較仍然較高，各組之間差異存在顯著性。這一結(jié)果可能是由于本研究中的GB的劑量較小，尚不足以完全抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生以及相關(guān)的炎癥改變。增加GB劑量是否能達(dá)到更好的抑制效果有待于進(jìn)一步探討。我們在前期的工作中也已經(jīng)確認(rèn)表明GB能夠有效地抑制膠原(collagen)，二磷酸腺苷(ADP)等血小板活化劑誘導(dǎo)的血小板聚集［10］。因此，我們認(rèn)為GB可能通過抑制血小板釋放反應(yīng)，減輕或延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展。最近還有一些新的來源于血小板的炎癥介質(zhì)不斷被發(fā)現(xiàn)，Coppinger等［15］報道了3個新的由血小板釋放的蛋白cylophilin A、SecretogramingIII和calumenin參與炎癥反應(yīng)，并在動脈粥樣硬化的斑塊中被檢出。這些研究對血小板在動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的重要作用提出了充分的證據(jù)。

綜上所述，我們的研究首次報道了PAF受體抑制劑GB有效減輕了ApoE－/－小鼠動脈粥樣硬化的程度，并能降低血漿RANTES含量。由于血小板分泌RANTES參與動脈粥樣硬化，GB能夠有效抑制血小板功能，因此，我們認(rèn)為GB能減輕或延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展，抑制炎癥反應(yīng)。這些保護(hù)效果可能與GB抑制血小板功能相關(guān)。本研究為動脈粥樣硬化防治提供了新的實驗依據(jù)。

［1］Aukrust P，Halvorsen B，Ueland T，et al.Activated platelets and atherosclerosis［J］.Expert Rev Cardiovasc Ther，2010，8(9):1297－307.

［2］Anfossi G，Russo I，Doronzo G，et al.Adipocytokines in atherothrombosis:focus on platelets and vascular smooth muscle cells［J］.Mediators Inflamm，2010，2010:174341.

［3］Evans D J，Jackman L E，Chamberlain J，et al.Platelet P2Y(12)receptor influences the vessel wall response to arterial injury and thrombosis［J］.Circulation，2009，119(1):116 － 22.

［4］Touvay C，Etienne A，Braquet P.Inhibition of antigen-induced lung anaphylaxis in the guinea-pig by BN 52021 a new specific paf－ acether receptor antagonist isolated from Ginkgo biloba［J］.A-gents Actions，1986，17(3 －4):371 －2.

［5］Muhlestein J B.Effect of antiplatelet therapy on inflammatory markers in atherothrombotic patients［J］.Thromb Haemost，2010，103(1):71－82.

［6］Kornen R R，Weber C.Platelet-derived chemokines in vascular remodeling and atherosclerosis［J］.Thromb Hemost，2010，36(2):163－9.

［7］Benveniste J，Hensn P M，Cochrane C G.Leukocyte-dependent histamine release from rabbit platelets:The role of IgE，basophils and a platelet-activating factor［J］.J Exp Med，1972，136(6):1356－77.

［8］Li R，Chen B，Wu W，et al.Ginkgolide B suppresses intercellular adhesion molecule-1 expression via blocking nuclear factor-κB activation in human vascular endothelial cells stimulated by oxidized low-density lipoprotein［J］.J Pharmacol Sci，2009，110(3):362－9.

［9］黃賤英，孫建寧，梅世昌，黃紀(jì)明.銀杏內(nèi)酯B對缺血/再灌腦損傷大鼠的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(2):269－72.

［9］Huang J Y，Sun J N，Mei S C，Huang J M.Protective effects of ginkgolide B on cerebra l ischem ia reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(2):269 －72.

［10］姜秀新，管斯斯，鮑 利，等.銀杏內(nèi)酯B對膠原或二磷酸腺苷刺激血小板活化后一氧化氮含量及血管舒張因子刺激磷酸蛋白磷酸化的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(11):2066－70.

［10］Jiang X X，Guan S S，Bao L，et al.Effects of ginkgolide B on NO generation and vasodilator-stimulated phosphoprotein phosphorylation following platelet activation induced by collagen or adenosine diphosphate［J］.J Clin Rehab Tiss Engin Res，2009，13(11):2066－70.

［11］von Hundelshausen P，Weber K S，Huo Y，et al.RANTES deposition by platelets triggers monocyte arrest on inflamed and atherosclerotic endothelium［J］.Circulation，2001，103(13):1772 －7.

［12］von Hundelshausen P，Koenen R，Sack M，et al.Heterophilic interactions of platelet factor 4 and RANTES promote monocyte arrest on endothelium［J］.Blood，2005，105(3):924 －30.

［13］Veillard N R，Kwark B，Pelli G，et al.Antagonism of RANTES receptors reduces atherosclerotic plaque formation in mice［J］.Circ Res，2004，94(2):253 －61.

［14］Schober A，Manka D，von Hundelshausen P，et al.Deposition of platelet RANTES triggering monocyte recruitment requires P-Selectin and is involved in neointima formation after arterial injury［J］.Circulation，2002，106(12):1523 －9.

［15］Coppiger J A，Cagney G，Toomey S，et al.Characterization of the protein released from activated platelets leads to localization of novel platelet protein in human atherosclerotic lesions［J］.Blood，2004，103(6):2096 －104.