內(nèi)嗎啡肽在小鼠樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)

李正紅，高 琴，葉紅偉，單立冬，龔 珊，蔣星紅

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，參與抗原的攝取、加工及提呈。DC最大的特點(diǎn)是能夠顯著刺激處女型或初始型T細(xì)胞(naive T cells)增殖，因此DC是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答過程中具有獨(dú)特的地位。DC除了單純的抗原捕獲、遞呈和對(duì)T細(xì)胞的協(xié)同刺激作用外，在特異性激活幼稚T細(xì)胞、聯(lián)結(jié)天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中也起著獨(dú)一無二的作用。

內(nèi)嗎啡肽(endomorphin，EM)是新發(fā)現(xiàn)的一種阿片樣四肽。EM有兩種:內(nèi)嗎啡肽-l(endomorphinl，EM-1，Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)和內(nèi)嗎啡肽-2(endomorphin-2，EM-2，Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)。它們有特異性的結(jié)構(gòu)，比其他的阿片肽如腦啡肽，對(duì)酶的分解作用有更強(qiáng)的耐受性，與Mu阿片受體有更高的親和力，被認(rèn)為是 Mu阿片受體的內(nèi)源性配體［1］。EM-1和EM-2廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)富含Mu受體的神經(jīng)元，并參與鎮(zhèn)痛［2，17］。

近年來，越來越多的研究表明，內(nèi)源性阿片肽能在免疫細(xì)胞中生成，是細(xì)胞免疫應(yīng)答的有力調(diào)控因素。在關(guān)節(jié)炎大鼠后爪分泌滑液的組織中［3］和在炎癥大鼠的炎癥爪局部組織及淋巴結(jié)中［4］，均發(fā)現(xiàn)EM-1和EM-2的水平有所升高，并且伴有Mu受體的高表達(dá)［3－4］。EM-1和 EM-2在外周免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞中都有表達(dá)［5］，并且通過抑制致炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來改變鼠腹腔巨噬細(xì)胞的功能［6－8］。盡管有很多的證據(jù)提示DC在免疫反應(yīng)中的作用，但DC是否產(chǎn)生內(nèi)嗎啡肽，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫熒光染色觀察EM-1和EM-2是否在樹突狀細(xì)胞表達(dá)，并進(jìn)一步研究不同的Toll樣受體的配體對(duì)樹突狀細(xì)胞分泌EM的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 鼠源集落刺激因子(Pepro-Tech，Rocky Hill，NJ);CD11+ 磁珠(Miltenyi Biotech，Bergish-Gladbach，Germany);Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 546標(biāo)記的二抗(both from Invitrogen，CA，USA);Zeiss LSM 510 共聚焦顯微鏡;12.5 mg·L－1poly(I∶C)，6 mg·L－1CpGODN，1 mg·L－1Pam3Cys(all from InvivoGen，San Diego，CA);1 mg· L－1LPS (lipopolysacchairde，脂 多 糖，Sigma Aldrich，St Louis，MO);抗EM-1多克隆的抗體 (1∶200)和抗 EM-2多克隆的抗體(1∶100)，購自Chemicon，USA。抗 CD11c的單克隆抗體(1∶30;clone:HL3)來源于BD-Pharmingen。EIA試劑盒購自Phoenix Pharmaceuticals Inc。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J♀鼠購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源的 DC的制備與培養(yǎng) 用 Inaba等［16］的方法來培養(yǎng)大量的DC，略作改動(dòng)。將7～8周齡的正常C57BL/6J鼠頸椎脫位處死，無菌條件下取完整的股骨、脛骨，剔凈周圍組織，離斷干骺端后，用皮試針抽吸RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗髓腔，獲得單細(xì)胞懸液;1 500 r·min－1離心10 min，棄上清后加入適量Tris-NH4Cl破解紅細(xì)胞，再用PBS洗滌兩次后用含10 μg·L－1GM-CSF、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，種于6孔板，接種密度為1×109～2 ×109·L－1(3 ～4 ml)·well－1。d 3，輕輕吸棄未貼壁細(xì)胞、全量換液。d 5，吸棄半量培養(yǎng)基，并補(bǔ)充該量。d 6、7，收集懸浮和半貼壁細(xì)胞。

采用CD11c免疫磁珠進(jìn)行磁性分選純化樹突狀細(xì)胞。用 20 mmol·L－1PBS(0.15%BSA，pH 7.12)洗滌細(xì)胞兩次，加入CD11c免疫磁珠，4℃反應(yīng)20 min，離心洗滌后將細(xì)胞懸液加入MS磁分離柱中進(jìn)行分離純化，獲取CD11c+的骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，所有操作根據(jù)autoMACS系統(tǒng)的廠商說明書進(jìn)行 (Miltenyi Biotech，Bergish-Gladbach，Germany)。采用PE標(biāo)記的倉鼠抗小鼠CD11c mAb，通過流式細(xì)胞儀(Florescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分析純化前后的DC純度。

1.2.2 免疫熒光染色 迄今為止，EM及其前體肽的核苷酸序列仍未知，因此用免疫熒光的方法檢測(cè)它們?cè)贒C的產(chǎn)生。采用的抗EM的抗體，系兔抗鼠的多克隆抗體，其特異性已被其他研究［4］所證明。抗EM-1和抗EM-2的抗體與其他的阿片肽(如內(nèi)啡肽和腦啡肽)之間都沒有交叉反應(yīng)性。在多重的切片中，染色的特異性用一抗或二抗的省略所證實(shí)。在這些陰性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)中，沒有陽性染色的結(jié)果。

為了證實(shí)在DC上的EM-1/EM-2的表達(dá)，在4孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的DC用雙重的免疫熒光技術(shù)進(jìn)行染色，共聚焦顯微鏡觀察。成熟和未成熟的DC載玻片用丙酮固定，隨后加入抗EM-1和抗EM-2的多克隆抗體和抗CD11c的單抗進(jìn)行免疫染色，4℃過夜孵育。洗去一抗后，加入相應(yīng)的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 546標(biāo)記的二抗，在室溫下孵育1 h。陰性對(duì)照包括:省略一抗，省略二抗和同型對(duì)照。

1.2.3 TLR配體影響EMs的分泌 由于TLR配體可以促進(jìn)DC的成熟［19］，并且導(dǎo)致致炎細(xì)胞因子的釋放，推測(cè)TLR配體可能影響EM的產(chǎn)生。培養(yǎng)7 d的DC，進(jìn)行純化。純化后的DC以5×105細(xì)胞/毫升的濃度培養(yǎng)于48孔培養(yǎng)板中，并且用以下條件來刺激:12.5 mg·L－1poly(I∶C);6 mg·L－1CpG ODN;1 mg·L－1Pam3Cys;1 mg·L－1LPS。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別收集各孔細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，檢測(cè)其EM-1和EM-2的分泌水平。未刺激的DC作為對(duì)照。

1.2.4 Enzyme immunoassay(EIA)檢測(cè) EM 采用EIA方法檢測(cè)EMs。本試劑盒采用競(jìng)爭結(jié)合的方法來間接測(cè)得EM的濃度。簡言之，可識(shí)別一抗的二抗預(yù)先包被在微量檢測(cè)板上，反應(yīng)體系中包括可識(shí)別EM的一抗和固定濃度的生物素標(biāo)記的EM。當(dāng)加入含EM的樣本或EM標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，這些未標(biāo)記的EM與生物素標(biāo)記的EM競(jìng)爭結(jié)合一抗，經(jīng)過嚴(yán)格的洗脫，將形成抗原－抗體復(fù)合物，包括EM－生物素標(biāo)記EM－一抗－二抗，由于鏈親和素(streptavidin)可與生物素以較高的親和力結(jié)合，因此加入鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(SA-HRP)后，可以通過顏色的深淺來間接反映樣本中的EM濃度。

每孔加入50 μl的待測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，25 μl的一抗以及25 μl的生物素標(biāo)記的EM;室溫孵育2 h后，洗脫5次;加入100 μl的鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫孵育1 h;洗脫6次;加入100 μl的底物，室溫孵育 1 h;用 100 μl的 2 mol·L－1HCl終止反應(yīng);用OD450nm讀取光吸收值，并計(jì)算結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Mann-Whitney U test用于比較不同試驗(yàn)組的差異。

2 結(jié)果

2.1 樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生EM CD11c分子系DC的表面膜分子，當(dāng)用Alexa544標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)，DC的細(xì)胞膜呈紅色。細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成EM的前體，并分泌產(chǎn)生EM，因此，當(dāng)用Alexa 488標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)，DC的胞質(zhì)呈綠色。我們的結(jié)果，如Fig 1A所示，說明了EM-1的免疫反應(yīng)性可以在活化的CD11c+DC的細(xì)胞質(zhì)中被檢測(cè)到，活化的CD11c+DC具有樹突消失和圓形的形態(tài)學(xué)特性。此外，EM-2的免疫反應(yīng)性也可以在活化的CD11c+DC中被檢測(cè)到(如Fig 1B)。在未活化的樹突狀細(xì)胞，EM-1和EM-2陽性細(xì)胞較少，當(dāng)用LPS刺激活化后，EM陽性細(xì)胞增加，表明了EM-1和EM-2在DC中可以被誘導(dǎo)性表達(dá)。

2.2 TLR配體影響EMs的分泌 免疫磁珠分選的CD11c+細(xì)胞，培養(yǎng)在48孔板中，加入不同的TLR配體刺激細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用EIA試劑盒測(cè)量培養(yǎng)上清液中的EM-1和EM-2的濃度。未刺激活化的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果表明，用TLR配體刺激活化的樹突狀細(xì)胞，與對(duì)照組相比，都能使上清液中EM濃度明顯升高。其中，LPS和poly(I∶C)促進(jìn)EM分泌的效果更加明顯，而且不同的TLR配體促進(jìn)EM-1和EM-2分泌的效果相似(Fig 2)。

Fig 1 Confocal microscopic pictures of endomorphin expression on DCDouble fluorescence staining showed the co-expression of EM-1(A)or EM-2(B)with CD11c in DC.DCs were activated by LPS for 24 h.Resting DCs were not activated by LPS.d，e，f.:co-expression of endomorphin-1 or endomorphin-2(green)with CD11c+dendritic cells(red)was detected in LPS-activated group;Inset at the left corner of(f)showing co-expression of EM and CD11c in dendritic cell(indicated by arrow)with high magnification.a，b，c:no co-expression of EM with CD11c was detected in non-activated，resting DCs，although a few EMs-positive cells(indicated by arrows)were observed.Control omitting primary antibody against EM

3 討論

在炎癥條件下，多種類型的免疫細(xì)胞可以在原位或在其培養(yǎng)物中檢測(cè)到具有阿片活性的肽類，表明免疫細(xì)胞能產(chǎn)生阿片類物質(zhì)。近年來，相繼有報(bào)道EMs和Mu受體在不同免疫細(xì)胞中表達(dá)。例如，在活化的CD4+/CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞中，Mu受體表達(dá)上調(diào)［9］，在腘淋巴結(jié)的髓質(zhì)區(qū)［4］和脾臟［5］中，在巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞和B細(xì)胞中都能檢測(cè)到EM-1和EM-2。在人體和小鼠的DC都有Mu受體的表達(dá)［10］。本研究表明，來源于骨髓的DC，經(jīng)LPS活化后，能檢測(cè)到EM-1/EM-2的表達(dá)。

Fig 2 Secretion of endomorphins from TLR ligands-treated DCsThe concentration of EMs in supernatant was measured using enzyme immunoassay kit.Non-activated DCs were used as control.Data were calculated from triplicate independent experiments.A:Concentration of EM-1 released from DCs in the presence of TLR ligands.B:Concentration of EM-2 released from DCs in the presence of TLR ligands.*P ＜ 0.05，＊＊P＜0.01 vs control

研究發(fā)現(xiàn)［18］，TLR存在于 APC(抗原遞呈細(xì)胞)、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞的細(xì)胞膜上，而且都有一個(gè)胞外的富亮氨酸的重復(fù)區(qū)域和一個(gè)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞質(zhì)區(qū)。實(shí)驗(yàn)中用骨髓來源的DC進(jìn)行離體培養(yǎng)，是為了模擬體內(nèi)DC成熟的條件，采用不同的Toll樣受體的配體進(jìn)行活化，TLR配體可能影響EM的產(chǎn)生。DC膜上的Toll樣受體能感應(yīng)微生物的產(chǎn)物［11－12］導(dǎo)致致炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表達(dá)，誘發(fā)局部免疫應(yīng)答反應(yīng)［13，19］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EM-1和EM-2不僅在DC的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，而且在培養(yǎng)DC的上清液中也測(cè)得到EM-1和EM-2，表明DC不僅能產(chǎn)生EMs，而且還能分泌到周圍環(huán)境中，至于EMs產(chǎn)生的機(jī)制還不太清楚。根據(jù)肽類物質(zhì)生成的一般規(guī)律，可能是從前體肽類降解而來，而Toll樣受體信號(hào)可能參與了調(diào)控。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DC生成的EMs能分泌到上清液中，這提示DC可以作為免疫調(diào)節(jié)因素，使EMs作用于鄰近的其他細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。由于DC自身也表達(dá)Mu受體［10］。因此，DC分泌的 EMs有可能作用于自身的Mu受體，以自分泌和旁分泌的方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。事實(shí)上，阿片肽也被認(rèn)為是細(xì)胞因子家族的成員，在神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織中發(fā)揮調(diào)控作用［14］。

在DC上發(fā)現(xiàn)有EMs和Mu受體的誘導(dǎo)性表達(dá)，具有重要的生物學(xué)意義。設(shè)想在炎癥早期，DC的滲入和參與，胞質(zhì)中的蛋白前體在Toll樣受體的配體作用下生成EMs。隨著DC的成熟，可以遷移至外周免疫組織和一些特異的器官(如發(fā)炎的滑膜組織)，在組織中，EM-1和EM-2被轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放，作用于鄰近的其他細(xì)胞。成熟的DC提供給T細(xì)胞的，不僅是抗原特異性的刺激信號(hào)和一系列的共刺激的分子，也釋放了一些可以使T細(xì)胞分化的細(xì)胞因子和其他化學(xué)因子。除了T細(xì)胞，釋放的EM-1和EM-2也可以作用在巨噬細(xì)胞，抑制促炎介質(zhì)的釋放，例如，IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF-α)［7］。總之，我們可以合理的推測(cè)，DC釋放的 EM-1和EM-2可以調(diào)節(jié)先天的和適應(yīng)性的免疫應(yīng)答。此外，DC可以遷移至有炎癥的組織，DC分泌的EM-1和EM-2可以作用在初級(jí)傳入的傷害性神經(jīng)元的末端，通過抑制P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽的產(chǎn)生來發(fā)揮強(qiáng)效的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，或者調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能［15］。

總之，在CD11c陽性的DC中EM-1、EM-2的誘導(dǎo)性表達(dá)，擴(kuò)展了我們對(duì)于免疫系統(tǒng)內(nèi)阿片肽在細(xì)胞內(nèi)分布的認(rèn)識(shí)，也提示了它們?cè)谡{(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)制和鎮(zhèn)痛方面的作用。

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