褪黑素對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)及NF-κB蛋白表達(dá)的影響

陳少雅，陳崇宏，楊麗娟，林 菁

褪黑素(melatonin，MT)是生物體內(nèi)普遍存在的一種吲哚類激素，在人體內(nèi)主要由松果體合成和分泌。大量研究表明，MT具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、調(diào)整時(shí)差、抗氧化、免疫增強(qiáng)、抗腫瘤［1］等作用，且相對(duì)安全。在抗腫瘤及腫瘤輔助治療方面存在理論價(jià)值和應(yīng)用前景。目前，中、晚期宮頸癌位居十大高死亡率惡性腫瘤之列。宮頸癌術(shù)后必須進(jìn)行化療，有臨床研究表明［2］宮頸癌患者血漿中MT水平較正常人低，故MT用于宮頸癌治療具備可能性。然而，國(guó)外已有的MT對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用的研究結(jié)果存在爭(zhēng)議［3］。MT抗腫瘤的機(jī)制目前仍不清楚。NF-κB在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要作用，是腫瘤預(yù)防和治療的潛在靶點(diǎn)［4］。因此，本研究旨在對(duì)MT抗HeLa細(xì)胞增殖活性作進(jìn)一步探討，并探究其與NF-κB蛋白表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥品及試劑 MT，Sigma公司產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)基干粉，Hyclone產(chǎn)品;胰蛋白酶為Difco進(jìn)口分裝;小牛血清，杭州四季青生物試劑公司產(chǎn)品;碘化丙啶(PI)，吖啶橙(AO)，溴化乙錠(EB)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品;其余試劑均為分析純產(chǎn)品;anti-NF-κB小鼠單抗;anti-β-actin山羊單抗;辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG、堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG、堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，均為Santa Cruz產(chǎn)品;堿性磷酸酶(AP)顯色底物為進(jìn)口分裝。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖抑制試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶充分消化后，以培養(yǎng)基配成適當(dāng)濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，180 μl/孔，實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度的藥物20 μl/孔(終濃度分別為 0.008、0.04、0.2 及 1 g·L-1)，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。在藥液分別作用1～5 d后，每天取1塊培養(yǎng)板，加入5 g·L-1MTT 20 μl/孔終止藥物作用，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，棄凈上清液，加DMSO 150 μl/孔，空白對(duì)照孔只加入 DMSO 150 μl/孔，振蕩10 min，492 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值(OD492)。直線回歸法計(jì)算IC50。

1.2.2 AO和EB雙染熒光顯微鏡觀察MT對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，離心，全培養(yǎng)基稀釋成5×107·L-1接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后加入MT使每孔細(xì)胞終濃度為200 mg·L-1，對(duì)照組加入等體積含10 ml·L-1無(wú)水乙醇的培養(yǎng)液，分別孵育1、2及3 d后，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩次后，稀釋成1010·L-1細(xì)胞懸液，取10 μl細(xì)胞懸液與1 μl AO 和1 μl EB 混合(AO、EB終濃度均為4 mg·L-1)，滴于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)NF-κB蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞分別以全培養(yǎng)基及含MT(終濃度為0.008、0.04、0.2 g·L-1)培養(yǎng)基孵育 1、2 及3 d，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，用去污裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)各組蛋白濃度，制備100 g·L-1SDS-PAGE，每泳道加總蛋白90 μg，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅-S 染色，50 g·L-1BSATBST常溫下封閉過(guò)夜后，分別加入anti-NF-κB小鼠單抗(一抗)、anti-β-actin山羊單抗反應(yīng)2 h，PBS漂洗2次，TBST漂洗1次，分別加入堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG反應(yīng)1 h，TBST漂洗3次，分別用AP、DAB顯色底物(避光反應(yīng))，NC膜上顯色至出現(xiàn)清晰的條帶，立即終止顯色，洗膜，晾干，拍照，膜永久保存。用 Gel-Pro Analyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度，相對(duì)含量用 NF-κB/β-actin灰度值比表示。

2 結(jié)果

2.1 MT對(duì)HeLa細(xì)胞的抗增殖活性 HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示，隨著MT劑量的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制增殖作用明顯增強(qiáng)，生長(zhǎng)曲線隨之下移。MT作用3 d，抑制 HeLa細(xì)胞的 IC50為61.71 mg·L-1(Fig 1)。

2.2 AO和EB雙染熒光顯微鏡觀察MT對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 熒光顯微鏡下，對(duì)照組經(jīng)胰酶消化的HeLa細(xì)胞呈圓形(Fig 2A);MT 1 g·L-1作用1、2、3 d組，胞膜溶解的壞死細(xì)胞隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多，凋亡細(xì)胞少見(Fig 2B、C、D)。由此可見，MT主要致HeLa細(xì)胞壞死而少致凋亡。

2.3 MT對(duì)HeLa細(xì)胞NF-κB蛋白水平的影響MT 0.2 g·L-1作用 1、2、3 d，對(duì) HeLa 細(xì)胞 NF-κB蛋白水平的抑制作用呈明顯的時(shí)間依賴性。作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯。MT 0.2 g·L-1作用1、2、3 d NF-κB蛋白水平明顯抑制，與對(duì)照組比較，P＜0.01;MT 0.2 g·L-1作用2及3 d較作用1 d的NF-κB蛋白水平低，MT 0.2 g·L-1作用3 d較作用2 d的 NF-κB 蛋白水平低，P ＜0.01(Fig 3)。

MT 0.008、0.04 及 0.2 g·L-1作用 3 d，對(duì) He-La細(xì)胞NF-κB蛋白水平的抑制作用呈明顯的濃度依賴性。MT 0.008、0.04及0.2 g·L-1作用3 d對(duì)NF-κB蛋白水平的抑制作用明顯，與對(duì)照組比較，P＜0.01;MT 0.04 及0.2 g·L-1較 MT 0.008 g·L-1組對(duì)NF-κB蛋白水平的抑制作用明顯，P＜0.01;MT 0.2 g·L-1較 MT 0.04 g·L-1對(duì) NF-κB 蛋白水平的抑制作用明顯，P＜0.01(Fig 4)。

Fig 1 Inhibiting activity of melatonin on HeLa cells by MTT assay( ± s，n=5)MT1:Treated with MT 8 mg·L-1;MT2:With 40 mg·L-1;MT3:With 200 mg·L-1;MT4:With 1 g·L-1

Fig 2 Morphological alterations of HeLa cells stained with AO/EB by fluorescene staining(×400)A:Control;B:Treated with melatonin 1 g·L-1for 1 d;C:for 2 d and D for 3 d.→，necrosis cells

3 討論

MT作為幾無(wú)毒性的內(nèi)源性激素，其抗腫瘤活性及應(yīng)用前景已引起廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外報(bào)道［5-7］多顯示MT對(duì)體內(nèi)、外腫瘤有抑制增殖作用。在多種體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株上，多家實(shí)驗(yàn)室均觀察到MT可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但有關(guān)抗腫瘤活性的有效劑量報(bào)道不一［3］，可能與體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系的類別、給藥時(shí)間、藥物的溶解度等實(shí)驗(yàn)條件不同有關(guān)。本課題組前期工作顯示MT對(duì)體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞系有抑制增殖作用，且主要表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，壞死程度呈劑量依賴性，未見明顯的細(xì)胞凋亡。由此可見，MT抑制HeLa細(xì)胞增殖是導(dǎo)致細(xì)胞壞死為主而非促發(fā)細(xì)胞凋亡。

Fig 3 The influences of melatonin on NF-κB levels on HeLa cells by Western blot analysis(±s，n=5)Group 1，treated with MT 0.2 g·L-1for 1 d;Group 2 for 2 d;Group 3 for 3 d.NF-κB/Relative densities，＊＊P ＜0.01 vs control;△△P＜0.01 vs group 1;○○P ＜0.01 vs group 2

Fig 4 The influences of melatonin on NF-κB levels on HeLa cells by Western blot analysis(±s，n=5)MT1:Treated with MT 0.008 g·L-1;MT2:With 0.04 g·L-1;MT3:With 0.2 g·L-1.NF-κB/Relative densities，＊＊P ＜ 0.01 vs control，△△P ＜0.01 vs MT1，○○P ＜0.01 vs MT2

MT的抗腫瘤作用機(jī)制廣泛而復(fù)雜［8-10］，目前主要的觀點(diǎn)包括抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用、對(duì)細(xì)胞代謝及細(xì)胞周期的影響，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子，干擾鈣調(diào)素和微管蛋白的功能，作用于MT1受體調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)等。有報(bào)道表明，MT通過(guò)抑制NF-κB活性而增強(qiáng)TNF-α所致的腫瘤細(xì)胞死亡［11］;皮質(zhì)酮抑制NF-κB來(lái)調(diào)制NA誘導(dǎo)的MT合成［12］。MT對(duì)HeLa細(xì)胞中高表達(dá)的NF-κB是否有影響未見相關(guān)報(bào)道。

NF-κB是廣泛存在于人體組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，最常見的家族成員是p65/p50異源二聚體，對(duì)眾多基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。NF-κB通常在胞質(zhì)中與抑制蛋白 IκB 結(jié)合呈非活性狀態(tài)，IκB-α 對(duì) NF-κB的活化起主要調(diào)控作用，NF-κB的活化主要依賴于IκB蛋白的磷酸化，而 IκB 蛋白的磷酸化在 IκB 激酶(主要為IκKβ)催化下進(jìn)行。激活的NF-κB移位入胞核后可上調(diào)多種靶基因的表達(dá)，包括多種細(xì)胞因子的表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［13］等密切相關(guān)。NF-κB在許多疾病發(fā)病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色［14-15］。有報(bào)道顯示［16］，NF-κB增高可促進(jìn)腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，并且導(dǎo)致腫瘤化療耐藥。NF-κB抑制劑已成為目前治療腫瘤的新策略。

鑒于MT和NF-κB作用及機(jī)制的復(fù)雜性、關(guān)聯(lián)性，為探究MT抑制HeLa細(xì)胞與NF-κB水平的關(guān)系，本研究采用Western blot法檢測(cè)不同濃度的MT對(duì)HeLa細(xì)胞 NF-κB的蛋白水平的影響。結(jié)果提示，MT 0.2 g·L-1作用 1、2 及 3 d，對(duì) HeLa 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的同時(shí)NF-κB蛋白水平下調(diào)，從MT作用2 d開始，呈時(shí)間依賴性。MT 0.008、0.04及0.2 g·L-1作用3 d，對(duì)HeLa細(xì)胞 NF-κB蛋白水平的下調(diào)呈明顯的濃度依賴性。說(shuō)明MT對(duì)HeLa細(xì)胞的抗增殖活性與NF-κB蛋白水平的下調(diào)可能有關(guān)。與文獻(xiàn)報(bào)道［15］相符。NF-κB與細(xì)胞因子的關(guān)系復(fù)雜，細(xì)胞因子TNF-α可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，HeLa細(xì)胞的壞死可能與MT抑制NF-κB而增強(qiáng)TNF-α功能有關(guān)［11］，也可能是MT抗腫瘤的復(fù)雜機(jī)制共同導(dǎo)致。

綜上所述，MT抑制HeLa細(xì)胞增殖的機(jī)制復(fù)雜，下調(diào) NF-κB水平可能與其抗腫瘤機(jī)制有關(guān)。NF-κB與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上各個(gè)抑制環(huán)節(jié)的關(guān)系如何?MT造成HeLa細(xì)胞壞死與NF-κB下調(diào)影響細(xì)胞因子的作用是否關(guān)聯(lián)?有待下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為開發(fā)MT及其類似物和NF-κB抑制劑用于腫瘤化療及化療增敏方面提供理論基礎(chǔ)。

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