青蒿琥酯納米粒的制備及其體外細胞抑制試驗

邢貞建，李 祥，陶 濤（廣州市胸科醫(yī)院，廣州市 510095）

青蒿琥酯納米粒的制備及其體外細胞抑制試驗

邢貞建＊，李 祥，陶 濤（廣州市胸科醫(yī)院，廣州市 510095）

目的：制備青蒿琥酯納米粒，并對其性質及體外細胞抑制作用進行研究。方法：以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為載體，采用自乳化方法制備青蒿琥酯納米粒。掃描電鏡觀察納米粒的形態(tài)，激光粒度儀測定納米粒的粒徑及其分布；考察納米粒的載藥量、包封率、體外釋放情況；MTT法考察納米粒對人白血病細胞株K562在不同時間（24、48、72h）的體外細胞抑制率，并與青蒿琥酯（原料藥）比較。結果：所制青蒿琥酯納米粒為圓球形，表面光滑，平均粒徑為（144±3.0）nm，Zeta電位是－31.5mV，平均載藥量和包封率分別為14%、84%；體外釋放試驗前期有明顯突釋現(xiàn)象，前24h累積釋放度為46%，其后釋放均勻，120h累積釋放度達65%，具有緩釋作用；其在72h時對細胞抑制率高于青蒿琥酯組（76.4%vs.59.1%），有較強抑制作用（P＜0.05）。結論：所制青蒿琥酯納米粒在體外具有較好的緩釋性，對K562細胞有較強的抑制作用。

青蒿琥酯；納米粒；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；制備；K562細胞；抑制作用

青蒿琥酯（Artesunate，ART）是具有倍半萜結構的抗瘧藥，化學名為二氫青蒿素-1，2-α-琥珀酸單酯。較之青蒿素，青蒿琥酯水溶性更好，效價更高，不易產(chǎn)生耐藥性，且其代謝產(chǎn)物二氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）抗瘧活性高，毒性小[1]。另有研究[2]發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯還具有抗腫瘤的作用。但是，青蒿琥酯同時也具有誘導肝藥酶的作用，首關效應明顯，且在體內代謝快，因此，現(xiàn)有的片劑、注射劑都具有上述缺點，故改進青蒿琥酯給藥方式、維持其體內濃度成為臨床需要。納米制劑具有提高藥物穩(wěn)定性、延長作用時間及對肝、脾等部位有靶向性等優(yōu)點[3]；而聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）具有生物降解性，最終降解為水和二氧化碳，生物安全性高，是理想的藥物載體[4]。因此，筆者選用PLGA為載體制備青蒿琥酯納米粒，同時考察其性質，探討青蒿琥酯納米制劑的可行性。

1 儀器與材料

Rotavapor R-114旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；Zeta-sizer 3000HS激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；TMP電子天平（德國Sartorius公司）；JSM-6330F型掃描電鏡（日本電子株式會社）；Waters 2487型高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)（美國Waters公司）。

PLGA（50/50，山東岱罡生物材料有限公司，相對分子量：15000）；青蒿琥酯原料藥（廣西桂林南藥有限公司，批號：070519，純度：＞98%）；青蒿琥酯、二氫青蒿素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100200-200202、100184-200401，純度：均＞98%）；泊洛沙姆（型號：188）、MTT、二甲基亞砜（DMSO）均由美國Sigma公司提供；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青蒿琥酯納米粒（自制，規(guī)格：每100mg含青蒿琥酯14mg）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

人白血病細胞株K562（購自中國醫(yī)學科學院血液學研究所）。

2 方法與結果

2.1 青蒿琥酯納米粒的制備

采用自乳化方法制備納米粒[5]。精密稱取24mg青蒿琥酯和120mg PLGA共溶于10mL油相中（丙酮-無水乙醇＝9∶1），將油相緩慢滴加到中速攪拌的0.1%泊洛沙姆水溶液60mL中。攪拌一段時間后，將上述溶液減壓旋轉蒸發(fā)至無丙酮氣味，然后于0.22μm濾膜過濾，得到納米膠體溶液。將該溶液于4℃超速離心（20000r·min－1）0.5h，沉淀加蒸餾水洗滌，同法再離心、洗滌3次，冷凍干燥得到青蒿琥酯納米粒。空白納米粒除不加藥物外，其余同法制備。

2.2 納米粒的形態(tài)學及粒徑考察

使用激光粒度儀測定納米粒的粒徑分布及Zeta電位，掃描電鏡下觀察納米粒的形態(tài)。

測定結果表明，納米粒表面帶負電荷，Zeta電位是－31.5mV。粒徑分布較窄，且基本呈正態(tài)分布，平均粒徑是（144±3.0）nm，多分散指數(shù)為0.155。掃描電鏡顯示，納米粒為類球形，表面光滑，大小均勻，粒子間基本無黏連。粒徑分布和納米粒形態(tài)分別見圖1、圖2。

2.3 藥物含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜圖。色譜柱：Ecosil C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.02mol·L－1硫酸銨溶液-12%三乙胺溶液（60∶40∶0.2，稀氨水調pH至4.5）；流速：1.0mL·min－1；進樣體積：20μL；柱溫：室溫；檢測波長：210nm。

取空白納米粒、青蒿琥酯標準品、二氫青蒿素標準品和樣品制備成溶液后進樣分析，色譜見圖3。

圖1 青蒿琥酯納米粒的粒徑分布Fig 1 The particle size distribution of Artesunate nanoparticles

圖2 青蒿琥酯納米粒掃描電鏡照片（×400000）Fig 2 Scanning electron micrographs of Artesunate nanoparticles（×400000）

圖3 高效液相色譜圖A.空白納米粒；B.青蒿琥酯標準品；C.二氫青蒿素標準品；D.供試品；1.青蒿琥酯；2.二氫青蒿素Fig 3 HPLC chromatograms A.blank nanoparticles；B.artesunate standard substance；C.dihydroartemisinin standard substance；D.test sample；1.artesunate；2.dihydroartemisinin

2.3.2 標準品溶液。精密稱取青蒿琥酯和二氫青蒿素標準品，加入乙腈溶解成一定濃度，作為標準品貯備液。再分別取該貯備液適量，用乙腈稀釋制成含青蒿琥酯分別為25、50、100、200、300、400、500μg·mL－1和含二氫青蒿素分別為10、20、30、40、50、100μg·mL－1的系列標準品溶液，備用。

2.3.3 線性關系考察。分別精密取“2.3.2”項下標準品溶液20μL進樣，以色譜峰面積（A）對標準品濃度（c）進行線性回歸。結果，青蒿琥酯的線性方程為c＝0.0018A+22.03（r＝0.997），線性范圍為25～500μg·mL－1，保留時間是8.268min；二氫青蒿素的線性方程為c＝0.0014A+23.6（r＝0.998），線性范圍為10～100μg·mL－1，保留時間是8.764min，見圖3。

2.3.4 精密度試驗。取“2.3.2”項下標準品溶液（含青蒿琥酯和二氫青蒿素分別為200、30μg·mL－1），連續(xù)進樣6次。結果，青蒿琥酯和二氫青蒿素峰面積的RSD分別為1.6%（n＝6）和1.5%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.5 重復性試驗。取一定量青蒿琥酯按“2.1”項下方法操作制備納米粒，測定其中青蒿琥酯和二氫青蒿素的濃度。結果，二者RSD分別為2.8%（n＝6）和2.5%（n＝6），表明本方法重復性較好。

2.3.6 回收率試驗。精密量取1mL空白納米粒溶液9份，置于5mL容量瓶中，分別加入適量青蒿琥酯和二氫青蒿素標準品溶液，乙腈定容，使青蒿琥酯的濃度為200、300、400μg·mL－1，二氫青蒿素的濃度為40、50、60μg·mL－1，每個濃度3份樣品。高速離心，進樣20μL。結果，青蒿琥酯和二氫青蒿素的平均回收率分別為99.4%（n＝9）和101.4%（n＝9），RSD分別為0.81%（n＝9）和2.07%（n＝9），表明本方法的準確度高。

2.4 納米粒的載藥量、包封率測定

收集“2.1”項下超速離心后的納米膠體溶液的上清液及洗液，采用HPLC法檢測其中藥物含量。精密稱取適量凍干的納米粒，加入少量二氯甲烷使納米粒完全溶解，揮干有機相，乙腈溶解殘渣，高速離心后進樣檢測。載藥量＝（納米粒中藥物量/納米粒重量）×100%；包封率＝[（加入總藥量－上清液中游離藥量）/加入總藥量]×100%。

結果，納米粒平均載藥量為14%（n＝3），平均包封率為84%（n＝3）。

2.5 納米粒的體外釋放

采用動態(tài)透析法測定納米粒的體外釋放情況[6]。精密稱取一定量納米粒，置于10mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）中，超聲分散，37℃、100r·min－1恒溫攪拌。分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、24、36、48、72、96、120h時各取1mL，超速離心取上清液；同時補加等量新鮮PBS。HPLC法檢測上清液中的藥物含量，計算累積釋放度，將累積釋放度與時間作圖得體外釋放曲線，見圖4。

圖4 青蒿琥酯納米粒體外釋放曲線Fig 4 In vitro drug release curves of Artesunate nanoparticles

由圖4可見，納米粒在體外有較好的緩釋性，前期有明顯突釋現(xiàn)象，前24h累積釋放度為46%，其后釋放均勻，120h累積釋放度達65%。

2.6 納米粒的體外細胞抑制作用

采用MTT法檢測細胞存活率。將人白血病細胞株K562置于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期細胞，調整細胞數(shù)為5×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每孔200μL。試驗組分為3組，青蒿琥酯納米粒組、青蒿琥酯（原料藥）組和空白納米粒組，對照組為未加任何物質的培養(yǎng)基。根據(jù)資料[7]，設定青蒿琥酯納米粒組和青蒿琥酯組的濃度均為0、5、10、20、40μmol·L－1，每個濃度設8個復孔，分別于24、48、72h每孔加入5g·L－1MTT溶液20μL，孵育4h，棄上清液，加入DMSO終止反應，微振蕩后，用酶標度光度計在波長570nm測定每孔的吸光度，并計算各組的細胞增殖抑制率，重復3次。細胞增殖抑制率＝（1－A試驗組/A對照組）×100%（A為吸光度）。即吸光度越大，抑制率越小。

試驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x ±s）表示，應用SPSS 13.0軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果表明，不同濃度青蒿琥酯納米粒與K562細胞共同孵育后，細胞生長受到抑制，并呈劑量依賴性。在3個不同的時間段，各濃度的抑制率都在72h達到最高峰，其中20μmol·L－1濃度的青蒿琥酯納米粒與其他濃度相比，抑制率具有顯著性差異（P＜0.01）。青蒿琥酯納米粒組與空白納米粒組、青蒿琥酯組在24、48、72h的吸光度相比，均有顯著性差異（P＜0.05），其中24、48h青蒿琥酯納米粒組抑制率小于青蒿琥酯組，而在72h抑制率則高于青蒿琥酯組，呈時間依賴性。結果詳見表1、表2。

表1 72h時不同濃度青蒿琥酯納米粒組吸光度值和抑制率比較（x ±s，n＝8）Tab 1 Comparison of absorbance and inhibition rate of different concentrations of Artesunate nanoparticles at 72h（x±s，n＝8）

表2 20μmol·L－1濃度時各組不同時間點吸光度值和抑制率比較（x ±s，n＝8）Tab 2 Comparison of absorbance and inhibition rate of different group of 20μmol·L－1at different tim（ex ±s，n＝8）

3 討論

青蒿琥酯在水中很快水解成二氫青蒿素，而發(fā)揮藥理作用的也是二氫青蒿素，因此青蒿琥酯可以說是一個前藥[8]。納米粒形成后青蒿琥酯包封在PLGA載體里，可減少酯鍵的水解，保持穩(wěn)定；同時，青蒿琥酯被聚酯類載體包裹后其降解產(chǎn)物絕大多數(shù)是二氫青蒿素；另PLGA作為載體本身對細胞毒性很小，用其制備的納米粒，后期可能因降解出乳酸使細胞生長的微環(huán)境pH值降低，從而抑制細胞生長。因此，青蒿琥酯采用PLGA為載體制備納米制劑有利于藥效的發(fā)揮[9]。

有研究[10]發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯單藥對白血病和結腸癌細胞株作用最強，對非小細胞肺癌細胞株作用最弱。因此，青蒿琥酯在抗白血病方面可能具有較大潛力，故本試驗選擇K562細胞，該細胞是慢性粒細胞白血病細胞系中的一種。青蒿琥酯納米粒在體外對其有抑制作用，提示青蒿琥酯納米?？赡軐Π籽〉闹委熡幸?。

關于青蒿琥酯的含量測定方法，已有許多文獻報道，如RP-HPLC法[11]、HPLC-堿水解-UV法[12]等。其中，HPLC-UV是最常用的方法，但青蒿琥酯本身紫外吸收波長在近紫外區(qū)（210nm左右），一般直接測定比較困難，有研究者先把青蒿琥酯水解后再進行測定[13]。由于水解受溫度、pH、時間等因素影響，因此，對各因素控制要求嚴格，操作條件的不同可致穩(wěn)定產(chǎn)物的量有明顯差異。本試驗參考以上文獻，經(jīng)多次試驗后采用本文所述色譜條件，結果表明有較好的效果。

自乳化方法制備的納米粒粒徑較小，表面帶負電荷，適合靜脈給藥。在體外，青蒿琥酯納米粒具有較好的緩釋性，由此推測其在體內可能也具有較好的緩釋性，從而延長青蒿琥酯的作用時間，克服其半衰期短的缺點。本文中的細胞試驗表明，青蒿琥酯納米粒對K562細胞有較強的抑制作用，且此作用呈劑量和時間依賴性。青蒿琥酯納米粒組在24、48h的抑制效果不如青蒿琥酯組，可能是由于開始時青蒿琥酯濃度較高，對細胞有顯著作用，但隨著時間的增加，青蒿琥酯逐漸被代謝消失，而青蒿琥酯納米粒則始終保持一定的濃度釋放，如青蒿琥酯納米粒組72h時抑制率高于青蒿琥酯組。在體內，青蒿琥酯或二氫青蒿素的半衰期只有幾十分鐘，因此，青蒿琥酯會很快被代謝，很難像體外一樣保持穩(wěn)定濃度。而青蒿琥酯經(jīng)PLGA包裹成納米粒后，可以防止藥物被迅速代謝，從而控制藥物釋放，延長作用時間。

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Preparation of Artesunate Nanoparticles and Its in Vitro Cell Inhibition Test

XING Zhen-jian，LI Xiang，TAO Tao（Guangzhou Municipal Chest Hospital，Guangzhou 510095，China）

OBJECTIVE：To prepare Artesunate nanoparticles，and to investigate their characteristics and inhibitory effect on cell in vitro.METHODS：Spontaneous emulsion solvent diffusion method was used to prepare Artesunate nanoparticles using poly（lactide-co-glycolide）（PLGA）as carrier.Then their morphology was detected by scanning electron microscorpe.The particle size and its distribution of nanoparticles were determined by laser particle measurer.The drug-loading amount，encapsulation rate and drug released characteristics were identified.The inhibition effects of nanoparticles on K562cells at different time（24h，48h，72h）were determined by MTT assay and compared with that of artesunate raw material.RESULTS：Prepared Artesunate nanoparticles were spherical and uniform with mean diameter of（144±3.0）nm.Zeta potential was －31.5mV.Their mean drug-loading amount and encapsulation rate were 14%and 84%，respectively.At early period of in vitro release test，Artesunate nanoparticles released suddenly.At first 24h，accumulative drug release rate was 46%and showed significant sustained release.Accumulative drug release rate was 65%at 120h.At 72h，cell inhibition rate of Artesunate nanoparticles was higher than that of artesunate raw material（76.4%vs.59.1%）.The inhibitory effect on K562cells of Artesunate nanoparticles was significant（P＜0.05）.CONCLUSION：Prepared Artesunate nanoparticles are characterized with sustained-release property.Artesunate nanoparticles can inhibit K562cells proliferation efficiently in vitro.

Artesunate；Nanoparticles；PLGA；Preparation；K562cells；Inhibition effect

R943；R979.1

A

1001-0408（2011）25-2357-04

2010-12-04

2011-04-08）