紫葉李樹葉中山奈酚的提取工藝研究

吳 波，張維農(nóng)，嚴(yán)建芳，張寒俊

1武漢工業(yè)學(xué)院分析測(cè)試中心;2武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院;3武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，武漢430023

紫葉李樹葉中山奈酚的提取工藝研究

吳 波1*，張維農(nóng)2，嚴(yán)建芳3，張寒俊1

1武漢工業(yè)學(xué)院分析測(cè)試中心;2武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院;3武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，武漢430023

該文測(cè)定了紫葉李樹葉中各黃酮苷元的含量，并對(duì)其中山奈酚的提取工藝進(jìn)行了研究，重點(diǎn)探討了采用乙醇法提取紫葉李樹葉中山奈酚的最佳工藝條件，試驗(yàn)結(jié)果表明:紫葉李樹葉中各黃酮苷元主要是槲皮素和山奈酚，乙醇提取紫葉李樹葉中山奈酚的最佳工藝參數(shù)為浸提劑乙醇濃度為70%﹑浸提溫度為50℃、料液比為1∶15、浸取時(shí)間為1.5 h。紫葉李樹葉中山奈酚的浸取率為92.7%，經(jīng)浸取、濃縮、水解、萃取、結(jié)晶工藝后，其紫葉李樹葉中山奈酚的總得率為56.6%，山奈酚的純度為90.6%。

紫葉李樹葉;山奈酚;提取工藝

山奈酚(又名黃芪苷元，山奈黃素，Kaempferol)的結(jié)構(gòu)為5，7，4'-三羥基黃酮醇，近年來，對(duì)其抗腫瘤、抗炎、抗氧化及抗菌等作用研究的比較多，它可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等研究中表現(xiàn)出顯著的活性［1-5］。薔薇科(Rosaceae)植物紫葉李(Prunus cerasifera)又叫紅葉李，是多年生落葉小喬木。原種產(chǎn)于亞洲西南部，較耐濕，有一定耐寒力，以葉色聞名，在整個(gè)生長(zhǎng)期滿樹紅葉，尤其春秋兩季葉色更艷，現(xiàn)在我國(guó)廣泛種植，資源豐富［6］。其樹葉，經(jīng)檢測(cè)，紫葉李樹葉中含較豐富的黃酮類物質(zhì)，其中以山奈酚較為突出［7］。傳統(tǒng)的山奈酚制備一般采用醇提法、超聲波法、逆流色譜法等從姜科植物山奈(kaempferia galangal L.)的根莖、百蕊草(Thesium chinense Turcz.)的全草、槐樹(Sophora japonica L.)的果實(shí)、高良姜(Alpinia officinarum Hance)的根莖提取，山奈酚也是銀杏與沙棘等植物有效部位中主要的黃酮苷元之一［8，9］。筆者首次以紫葉李樹葉為原料，采用醇提法提取山奈酚，對(duì)提取工藝、相關(guān)影響因素等進(jìn)行了一番探討，為其今后合理的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

電熱恒溫水浴鍋:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)藥設(shè)備廠;HS80A恒溫振床:中科院武漢科學(xué)儀器廠; RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;SHZ-III型循環(huán)水真空泵:上海亞榮生化儀器廠;GZX-9140ME數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:上海迅達(dá)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JB90-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī):上海標(biāo)本模型廠;VARIAN ProStar 210泵;7725I型手動(dòng)進(jìn)樣器;VARIAN363熒光檢測(cè)器;Waters柱后衍生系統(tǒng)。

槲皮素(Quercetin)(含量≥98%國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，桑色素(Morin hydtate)(含量≥98%購(gòu)于Fluka)，山奈酚(Kaempferol)(含量≥98%上海友思);無水乙醇(分析純);水(自制雙重蒸餾水);其它試劑為分析純。紫葉李樹葉采于武漢工業(yè)學(xué)院，3月和4月采葉，在60℃烘干、粉碎，10℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫葉李樹葉及提取步驟中黃酮苷元的測(cè)定

1.2.1.1 紫葉李樹葉中黃酮苷元的測(cè)定:稱取粉碎的樹葉約5 g于250 mL碘量瓶，準(zhǔn)確加入70%乙醇100 mL，50℃振蕩浸取兩個(gè)小時(shí)后，補(bǔ)足70%乙醇，搖勻。取5.00 mL浸取液，加入1 mL濃HCl(含0.2 g苯酚/mL)通N2、封口，在80℃下水解兩小時(shí)后，用無水乙醇用定容于10 mL，然后離心(10000 r/ min，40 s)，待測(cè)。

1.2.1.2 提取步驟中黃酮苷元的測(cè)定:準(zhǔn)確移取各工序中的浸取液5.00 mL，按1.2.1.1加1 mL濃HCl、封口、水解、定容、離心、待測(cè)。以上樣液中黃酮苷元的HPLC測(cè)定方法及條件見文獻(xiàn)［7］。紫葉李樹葉中黃酮苷元的含量按下列公式計(jì)算:

式中:Y為黃酮苷元按線性回歸方程計(jì)算的進(jìn)樣液的濃度(g/ml);w紫葉李樹葉的稱樣量(g)提取率(%)=提取黃酮苷元的絕對(duì)量/(原料中相應(yīng)黃酮苷元的含量×稱樣量)×100%

1.2.2 紫葉李樹葉提取山奈酚最佳工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Design of L9(34)orthogonal test

1.2.3 試樣溶液的制備

稱取100 g的粉碎的紫葉李樹葉，按15∶1的液料比加70%乙醇，在50℃水浴下攪拌1.5 h，過濾，濾餅用適量的70%乙醇沖洗，合并濾液，將其減壓濃縮后，加濃HCl，調(diào)節(jié)HCl濃度為2 mol/L，添加還原劑(0.5%w/v)，抽真空、通N2、封口，在80℃下水解2 h，冷卻后用200 mL乙醚萃取(三次)，將乙醚萃取液減壓濃縮后用無水乙醇溶解，過濾，結(jié)晶得山奈酚產(chǎn)品，按原色譜條件測(cè)其相應(yīng)峰的面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，其譜圖見圖1。

圖1 樣品的高效液相色譜圖(1.槲皮素;2.山奈粉)Fig.1 HPLC chromatogram of sample(1.Quercetin;2. Kaempferol)

2 結(jié)果與分析

2.1 紫葉李樹葉中各黃酮苷元的測(cè)定結(jié)果

按照“1.2.1.1”的方法測(cè)定紫葉李樹葉中槲皮素和山奈酚的平均含量分別為1.02%和3.21%，山奈酚占其總黃酮苷元為75.8%。本結(jié)果以紫葉李樹葉中山奈酚實(shí)際的“真實(shí)”含量，作為以下計(jì)算提取效果的依據(jù)。

2.2 提取劑及提取方式的選擇

分別用堿性水溶液(pH=9.00)、70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮溶液按“1.2.1.1”的方法分別提取、測(cè)定，其山奈酚的提取率分別為65.2%、92. 1%、91.4%和90.8%，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，堿性水溶液提取率較低，故棄之，乙醇、甲醇、丙酮其提取率差不多，從生產(chǎn)安全因素考慮，采用70%乙醇較適宜，所以以下研究均以乙醇為溶劑。

在提取方式上，目前采用超聲波、微波的比較多，而超聲波其作用面和深度是有限的，而微波其反應(yīng)罐體積不大，這兩種方式并不適合于大規(guī)模生產(chǎn)制備，在本試驗(yàn)中選擇攪拌結(jié)合控溫的方式進(jìn)行。

2.3 乙醇濃度對(duì)浸取效果的影響

分別用不同的乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%和90%)，按上述試驗(yàn)操作步驟，在50℃下，攪拌回流提取時(shí)間為2 h，液料比為15∶1，提取，按“1.2.1.2”步驟進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，當(dāng)乙醇濃度大于70%以后，其提取率大幅下降，這可能與其所連結(jié)的糖苷鍵有關(guān)?？紤]到后面的過濾工序及提取劑極性增大會(huì)給后序的純化帶來不利，因此乙醇濃度≤70%為好。

圖2 乙醇濃度對(duì)紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.4 溫度對(duì)浸提效果的影響

分別用不同的溫度(30、40、50、60、70℃和80℃)，按上述試驗(yàn)操作步驟，以70%乙醇為提取劑，攪拌回流提取時(shí)間為2 h，液料比為15∶1，提取，按1.2.1.2步驟進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見圖3，圖中可以看出，提取溫度在50℃為宜，溫度太高可能導(dǎo)致山奈酚的氧化。

圖3 溫度對(duì)紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.5 液料比對(duì)浸提效果的影響

分別用不同的液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1)，按上述試驗(yàn)操作步驟，以70%乙醇為提取劑，在50℃下，攪拌回流提取時(shí)間為2 h，提取，按1.2.1.2步驟進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖4。從圖中可以看出液料比為15∶1時(shí)，浸提已達(dá)到較好的效果，再增加溶劑的量對(duì)提取率影響不大，故以液料比為15∶1時(shí)較好。

圖4 液料比對(duì)紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.4 Effect of the ratio of material weight to solvent volume(w/v)on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.6 浸提時(shí)間對(duì)浸提效果的影響

分別用不同的浸提時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)，按上述試驗(yàn)操作步驟，以70%乙醇濃度為提取劑，在50℃下，液料比為15∶1時(shí)，提取，按1.2.1.2步驟進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖5.從圖中可以看出浸取時(shí)間在1.5 h就可以達(dá)到比較好的效果。

圖5 浸提時(shí)間對(duì)紫葉李樹葉中山奈酚浸提效果的影響Fig.5 Effect of extracting time on the extraction efficiency of kaempferol from P.cerasifera leaves

2.7 正交試驗(yàn)確定提取的最佳條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)山奈酚得率影響較大的4個(gè)因素(每個(gè)因素取三個(gè)水平):溶劑乙醇濃度(%)、液料比、溫度(℃)、浸提時(shí)間(h)進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，見表1。正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。從表2試驗(yàn)結(jié)果可以看出:極差分析為C＞A＞D＞B，提取紫葉李樹葉中山奈酚的最佳條件為A2B2C1D1，即乙醇濃度為70% ，料液比為1∶15，溫度為50℃ ，浸提時(shí)間為1.5 h。經(jīng)驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表明:山奈酚提取率可達(dá)92.7%。

表2 Lg(3)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiment(n=3)

2.8 浸出物的水解

紫葉李樹葉的浸出物，其黃酮主要以其苷的形態(tài)存在［7］，需經(jīng)水解變成苷元，目前，水解方式一般有酶解和酸水解兩種。β-糖苷酶水解時(shí)，其反應(yīng)條件溫和，對(duì)黃酮的形態(tài)影響不大，但反應(yīng)中轉(zhuǎn)化率不高，易形成多種產(chǎn)物。酸水解，主要以2 mol/L的氫質(zhì)子的鹽酸、硫酸在一定溫度下進(jìn)行［10，11］，反應(yīng)中要注意對(duì)黃酮的保護(hù)，黃酮在反應(yīng)中可完全轉(zhuǎn)化成苷元。本試驗(yàn)采用2 mol/L的鹽酸，在80℃下水解，通過添加還原劑(0.5%w/v)、抽真空、通N2、封口來保護(hù)黃酮，經(jīng)檢測(cè)，山奈酚在水解過程中其提取率可達(dá)90%以上。

2.9 在最佳條件下提取紫葉李樹葉中山奈酚的重現(xiàn)性

按步驟“1.2.3”進(jìn)行樣品的制備，結(jié)果見表3，從表中可以看出最終產(chǎn)品中山奈酚的平均含量為90.6%，其平均得率為56.6%。

表3 從紫葉李樹葉中提取山奈酚試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of kaempferol experiment from Prunus cerasifera leaves(n=3)

3 結(jié)論

本文對(duì)紫葉李樹葉中各黃酮苷元含量進(jìn)行了測(cè)定，重點(diǎn)探討了采用乙醇提取法提取紫葉李樹葉中山奈酚化合物的最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明:紫葉李樹葉中槲皮素、山奈酚的含量分別為1.02%、3.21%;乙醇提取法的最適工藝參數(shù)是浸提劑乙醇濃度為70%、浸提溫度為50℃、液料比15∶1、浸提時(shí)間為1.5 h，山奈酚提取率可達(dá)92.7%，經(jīng)浸取、濃縮、水解、萃取、結(jié)晶工藝后，其紫葉李樹葉中山奈酚的總得率為56.6%，山奈酚的純度為90.6%，本項(xiàng)研究為紫葉李樹葉中黃酮的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Optimum Extraction Technology of Kaempferol in Prunus cerasifera Leaves

WU Bo1*，ZHANG Wei-nong2，YAN Jian-fang3，ZHANG Han-jun11Center of Analysis and Measurement，Wuhan Polytechnic University;2Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University;3Chemical and Environmental Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China

The content of flavonoids in Prunus cerasifera leaves and its extraction technology were studied in this paper. By means of ethanol extracting，the optimum extraction conditions of kaempferol in P.cerasifera leaves were determined. The results showed that the content of quercetin and kaempferol were major flavonoids in P.cerasifera leaves，the optimum conditions of ethanol extracting were obtained as follows:70%ethanol as extraction solvent at 50℃for 1.5 h，and the ratio of material to solvent was 1∶15.Using the technological parameters above mentioned，the average extraction rate of kaempferol was 92.7%.After extracting，concentration，hydrolyzing，extraction and crystal，the average recoveries and product purity of kaempferol were 56.6%and 90.6%，respectively.

Prunus cerasifera leaves;kaempferol;extraction technology

1001-6880(2011)05-0952-04

2010-08-13 接受日期:2010-10-28

湖北省教育廳重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(D20101712)

*通訊作者 Tel:86-013006153299;E-mail:wb@whpu.edu.cn

Q946.91;R284.2

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