甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞生物活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

張紅蓮，鄭 龍，邊艷珠，張軍芳，王建華*

1河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊050017;2河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，石家莊050051; 3河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊050017

甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞生物活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

張紅蓮1，鄭 龍3，邊艷珠2，張軍芳1，王建華1*

1河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊050017;2河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，石家莊050051;3河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊050017

為探討甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)體外培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖與分化作用的影響，用改良的組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞，在成骨細(xì)胞體系中以不同濃度加入甲氧補(bǔ)骨脂素，MTT法檢測加藥后不同時(shí)間細(xì)胞的增殖情況;用對(duì)硝基苯二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法(PNPP)測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性，用改良的Lowry法測蛋白含量;用放射免疫法測定細(xì)胞內(nèi)骨鈣素含量。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，甲氧補(bǔ)骨脂素組在24 h和36 h時(shí)促進(jìn)體外大鼠成骨細(xì)胞增殖的作用更明顯;在24、48 h和72 h時(shí)均能提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性(ALP)和骨鈣素(BGP)的分泌。甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞的增殖與分化均有明顯的促進(jìn)作用。

成骨細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞分化;骨鈣素;甲氧補(bǔ)骨脂素

補(bǔ)骨脂性溫，味辛微苦，歸腎、脾經(jīng)，具溫補(bǔ)腎陽之功效。含補(bǔ)骨脂素(psoralen)、異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)、甲氧補(bǔ)骨脂素(methoxypsoralen)等呋喃香豆素類化合物。香豆素類化合物為植物雌激素之一。有研究表明甲氧補(bǔ)骨脂素聯(lián)合長波紫外線(UVA)有促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶活性的作用［1］。前文［2］報(bào)道了補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性有明顯促進(jìn)作用，本文繼續(xù)探討甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響，對(duì)進(jìn)一步研究補(bǔ)骨脂香豆素類植物雌激素防治骨質(zhì)疏松的作用及中藥新藥開發(fā)有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生24 h內(nèi)SD系乳大鼠:性別體重不限。河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):810010。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(GIBCO);胎牛血清(北京燕生生物技術(shù)有限公司);Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);堿性磷酸酶試劑盒(保定長城試劑有限公司，批號(hào): 20090422);甲氧補(bǔ)骨脂素(8-Methoxypsoralen)(上海融禾生物制品有限公司，含量 98%，批號(hào): 080707);骨鈣素放免試劑盒(天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào):200907);XDS-1B型倒置相差顯微鏡(OLYMPUS);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國NATURE公司);TECAN酶標(biāo)儀(奧地利);XH-6020型γ-放射免疫計(jì)數(shù)器(國營西安二六二廠)。

1.3 新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

無菌條件下，取出生后24 h以內(nèi)的大鼠乳鼠顱蓋骨，用平衡鹽溶液PBS沖洗數(shù)次，放入0.25%的胰蛋白酶溶液中，剔除骨表面被膜及軟組織，將骨片剪成1～3 mm3的骨粒，棄去胰蛋白酶溶液。在0.1%膠原酶Ⅱ中室溫消化45 min，將消化液棄去，平衡鹽溶液PBS洗三遍。將骨粒分散于100 mL培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后，將骨粒棄去，細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打傳代，置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞傳至第5代，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色鑒定所用細(xì)胞為成骨細(xì)胞［3］。細(xì)胞純度超過90%以上。

1.4 MTT法測細(xì)胞生長曲線

取傳至第5代培養(yǎng)的細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，制成1×104個(gè)/ml的DMEM細(xì)胞懸液，然后在96孔板的各孔內(nèi)準(zhǔn)確接種相同數(shù)量的細(xì)胞。分別在培養(yǎng)1，2，3，4，5，6 d后，每天取8個(gè)孔，每孔加入MTT 20 μL，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基后加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，10 min后用酶標(biāo)儀測定492 nm吸光度。最后用Microsoft Excel XP軟件繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 成骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的測定

將成骨細(xì)胞按2×104/mL密度接種于96孔板，待細(xì)胞70%融合后，換加含不同濃度的甲氧補(bǔ)骨脂素(10-9～10-5mol/L)的無血清培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)12 h，24 h，36 h后，每孔加入MTT 20 μL，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基后加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，10 min后用酶標(biāo)儀測定492 nm吸光度。

1.6 成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)的測定

將成骨細(xì)胞按2×104/mL密度接種于24孔板，待細(xì)胞70%融合后，換加含不同濃度的甲氧補(bǔ)骨脂素(10-9～10-5mol/L)的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24，48，72 h后，分別將兩塊24孔板取出，吸取培養(yǎng)基用于骨鈣素測定。細(xì)胞用PBS沖洗3次后，每孔加入250 μL 0.1%TritonX100溶液，吹打細(xì)胞，10 min后，收集每孔的溶液，用于堿性磷酸酶及蛋白質(zhì)的測定。堿性磷酸酶(ALP)測定采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動(dòng)力學(xué)法，并用Lowry法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，結(jié)果用蛋白含量校正，以每克蛋白中堿性磷酸酶國際單位(U/mg protein)表示。骨鈣素測定采用放射免疫法(RIA)，按試劑盒說明進(jìn)行，以ng/mL表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間差異比較用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法繪制生長曲線

接種后的第1 d開始，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增較慢，為細(xì)胞生長適應(yīng)期，以后細(xì)胞增長加速，第5 d達(dá)到高峰，以后增長速度逐漸減慢，見圖1。

2.2 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

大鼠成骨細(xì)胞在含不同濃度甲氧補(bǔ)骨脂素(10-9～10-5mol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，濃度為10-6mol/L和10-5mol/L與空白組比較有促增殖作用(P＜0.05);培養(yǎng)24 h，與空白組比較，各個(gè)濃度均有促增殖作用，其中10-5mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L作用較為明顯(P＜0.01);培養(yǎng)36 h，各個(gè)濃度與空白組比較均有顯著的促增殖作用(P＜0.01)，見表1。

2.3 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響

2.3.1 對(duì)堿性磷酸酶活性的影響

堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志［4］。大鼠成骨細(xì)胞在含不同濃度甲氧補(bǔ)骨脂素(10-9～10-5mol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，與空白組比較，濃度為10-7、10-8和10-9mol/L的甲氧補(bǔ)骨脂素可以提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。培養(yǎng)48 h，濃度為10-7、10-8、10-9mol/L促進(jìn)堿性磷酸酶活性的作用，其中10-9mol/L作用較為顯著(P＜0.01)。培養(yǎng)72 h，與空白組比較，濃度為10-7、10-8、10-9mol/L有促進(jìn)堿性磷酸酶活性的作用(P＜ 0.05)，見表2。

2.3.2 對(duì)骨鈣素水平的影響

骨鈣素是成骨細(xì)胞分化的晚期標(biāo)志［3］。大鼠成骨細(xì)胞在不同濃度的甲氧補(bǔ)骨脂素存在下培養(yǎng)24 h，1×10-7、1×10-8mol/L和1×10-9mol/L可提高大鼠成骨細(xì)胞骨鈣素的表達(dá)水平，培養(yǎng)48 h后，1× 10-8mol/L繼續(xù)保持高表達(dá)水平，提高成骨細(xì)胞骨鈣素的表達(dá);培養(yǎng)72 h后，僅1×10-9mol/L促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞骨鈣素的分泌，見表3。

圖1 MTT法測大鼠成骨細(xì)胞生長曲線Fig.1 Growth curve of rat osteoblast cells by MTT

表1 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響(吸光度A，n=10，±s)Table 1 Effect of 8-methoxypsoralen on the proliferation of osteoblast(A，n=10，±s)

表1 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響(吸光度A，n=10，±s)Table 1 Effect of 8-methoxypsoralen on the proliferation of osteoblast(A，n=10，±s)

注:不同濃度甲氧補(bǔ)骨脂素組與空白對(duì)照組相比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，下同。Note:Group of 8-methoxypsoralen with different concentrations compared with blank.*P＜0.05，＊＊P＜0.01.The same as follow.

濃度Concentration (mol/L)甲氧補(bǔ)骨脂素8-methoxypsoralen培養(yǎng)時(shí)間Period of incubation(h) 12 24 36 0 0.315±0.046 0.276±0.019 0.231±0.024 1×10-5 0.348±0.024* 0.319±0.023＊＊ 0.321±0.026＊＊1×10-6 0.352±0.033* 0.296±0.017* 0.283±0.018＊＊1×10-7 0.324±0.031 0.297±0.019* 0.273±0.026＊＊1×10-8 0.316±0.043 0.310±0.026＊＊ 0.313±0.033＊＊1×10-9 0.323±0.034 0.313±0.017＊＊ 0.325±0.023＊＊

表2 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響(U/mg，n=8，±s)Table 2 Effect of 8-methoxypsoralen on the ALP activity of osteoblast(U/mg，n=8，±s)

表2 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響(U/mg，n=8，±s)Table 2 Effect of 8-methoxypsoralen on the ALP activity of osteoblast(U/mg，n=8，±s)

濃度Concentration (mol/L)甲氧補(bǔ)骨脂素8-methoxypsoralen培養(yǎng)時(shí)間Period of incubation(h) 24 48 72 0 0.709±0.144 1.197±0.366 1.788±0.186 1×10-5 0.837±0.207 1.576±0.457 1.730±0.277 1×10-6 0.823±0.082 1.370±0.396 1.599±0.293 1×10-7 0.923±0.082* 1.805±0.779* 2.226±0.358* 1×10-8 1.379±0.155＊＊1.849±0.453* 2.242±0.369* 1×10-9 1.332±0.252＊＊2.200±0.340＊＊2.258±0.712 *

表3 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞分泌骨鈣素的影響(ng/mL，n=8，±s)Table 3 Effect of 8-Methoxypsoralen on the osteocalcin secretion of osteoblast(ng/mL，n=8，±s)

表3 甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞分泌骨鈣素的影響(ng/mL，n=8，±s)Table 3 Effect of 8-Methoxypsoralen on the osteocalcin secretion of osteoblast(ng/mL，n=8，±s)

濃度Concentration (mol/L)甲氧補(bǔ)骨脂素8-methoxypsoralen培養(yǎng)時(shí)間Period of incubation(h) 24 48 72 0 0.162±0.075 1.222±0.293 1.084±0.532 1×10-5 0.621±0.390 1.430±0.429 1.024±0.337 1×10-6 0.385±0.142 1.260±0.420 1.397±0.417 1×10-7 0.868±0.457* 1.215±0.330 1.416±0.268 1×10-8 1.338±0.941＊＊1.851±0.394* 1.466±0.361 1×10-9 1.541±0.227＊＊1.478±0.254 2.065±0.684*

3 討論

成骨細(xì)胞是參與骨代謝的重要細(xì)胞，對(duì)骨組織的生長發(fā)育、損傷修復(fù)、骨代謝平衡和骨量維持起關(guān)鍵作用，它與破骨細(xì)胞共同維持著骨代謝的平衡。成骨細(xì)胞的主要功能為合成分泌堿性磷酸酶和合成骨鈣素等非膠原蛋白，并誘導(dǎo)基質(zhì)礦化，直接參與骨形成。一旦成骨細(xì)胞衰老，其生成不足和功能降低，將直接導(dǎo)致骨形成減少，引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂 Psoralea corylifolia L.的成熟果實(shí)，具有溫補(bǔ)腎陽之功效。中醫(yī)認(rèn)為，腎主骨生髓。研究表明，許多補(bǔ)腎中藥具有防治骨質(zhì)疏松的作用［6］。有實(shí)驗(yàn)顯示用含不同濃度補(bǔ)骨脂注射液的DMEM培養(yǎng)成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞的增殖有顯著促進(jìn)作用［7］。本實(shí)驗(yàn)探討了甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖分化的影響，結(jié)果顯示，甲氧補(bǔ)骨脂素具有促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖分化的作用。甲氧補(bǔ)骨脂素組在24 h和36 h時(shí)促進(jìn)體外大鼠成骨細(xì)胞增殖的作用更明顯;在24 h、48 h和72 h時(shí)均能促進(jìn)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性(ALP)和骨鈣素(BGP)的分泌。甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)成骨細(xì)胞除刺激增殖外，對(duì)ALP活性和骨鈣素的分泌均有較好刺激作用，說明甲氧補(bǔ)骨脂素在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，也能促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟。因而可提高成骨細(xì)胞骨形成的功能，為骨質(zhì)疏松癥防治提供了一條途徑。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的直接作用，其作用機(jī)理尚待深入探討。此外，人體是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，骨代謝受多種激素和因子的影響，甲氧補(bǔ)骨脂素對(duì)整體防治骨質(zhì)疏松的作用有待于骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的影響實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 Mainlin GI，Hornicek FJ，Banovac K，et al.Interaction of cultured rat osteoblasts with 8-methoxypsoralen during irradiation with long-wave ultraviolet light.Biochem Biophys Res Commun，1995，207;877-881.

2Wang JH(王建華)，Wang Y(王艷)，Pan YM(潘永梅).Effects of psoralen on proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2007，19;844-846.

3 Situ ZQ(司徒鎮(zhèn)強(qiáng))，Wu JZ(吳軍正).Cell Culture(細(xì)胞培養(yǎng)).Xi'an:World Book Publishing Company，2004.160-164.

4Jin WF(金慰芳)，Zhu WG(朱文管)，Wang HF(王洪復(fù))，et al.Effects of HU-ECS on proliferation，differentiation and mineralization of cultured osteoblasts in vitro.Chin J Osteop (中國骨質(zhì)疏松志)，2001，7:9-11.

5 Li E(李恩)，Kong DJ(孔德娟)，Yang XH(楊學(xué)輝)，et al.Effects of kidney-tonifying chinese medicinal herbs on prevention of rat osteoporosis.Chin J Osteoporos(中國骨質(zhì)疏松志)，2002，8:166-170.

6 Lin JZ(林舉擇)，Chen SK(陳升愷)，Luo JD(羅家棟).The proliferatinve effect of psoralea injection on in-vitro-cultivated rat osteoblasts.J Tradit Chin Orthop Traumatol(中醫(yī)正骨)，2004，6:326-328.

Effects of 8-Methoxypsoralen on Proliferation and Differentiation of Cultured Osteoblasts in vitro

ZHANG Hong-lian1，ZHENG Long3，BIAN Yan-zhu2，ZHANG Jun-fang1，WANG Jian-hua1*1Faculty of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;2Isatopic Laboratory，Hebei Provincial People's Hospital，Shijiazhuang 050051，China;3Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Shijiazhuang 050017，China

To study the effects of 8-methoxypsoralen on proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro，MTT，PNPP and RIA were used separately to observe the proliferation，the activity of ALP and the content of osteocalcin of osteoblasts cultured in vitro with 8-methoxypsoralen of different concentration in it for different incubation periods.Protein was measured by Lowry.The effects of promoting proliferation of rat osteoblasts cells in vitro after 24 h and 36 h were more marked by the groups of 8-methoxypsoralen compared with the control group.The activity of alkaline phosphate(ALP)and secretion of osteocalcin(BGP)were stimulated by 8-methoxypsoralen after 24，48 h and 72 h incubation.It was demonstrated that 8-methoxypsoralen has the effects on stimulating the proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro.

osteoblast;proliferation;differentiation;osteocalcin;8-methoxypsoralen

1001-6880(2011)05-0927-04

2009-08-11 接受日期:2010-04-27

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2009001072)，河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 09276418D-14)，河北省中醫(yī)藥管理局課題(2007116)

*通訊作者 E-mail:smith_wang2000@126.com

R285.5

A