海綿共附生疣孢菌FIM06031細(xì)胞毒活性代謝產(chǎn)物的研究

聶毅磊，王傳喜，鄭永標(biāo)，林 如，許麗艷，彭 飛，方東升，連云陽(yáng)，江 紅*

1福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350007; 2福建師范大學(xué)生命科學(xué)院，福州350108;3汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，汕頭515041

海綿共附生疣孢菌FIM06031細(xì)胞毒活性代謝產(chǎn)物的研究

聶毅磊1，王傳喜1，鄭永標(biāo)2，林 如1，許麗艷3，彭 飛1，方東升1，連云陽(yáng)1，江 紅1*

1福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350007;2福建師范大學(xué)生命科學(xué)院，福州350108;3汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，汕頭515041

利用正相硅膠、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20和反相C18柱層析等方法，從海綿共附生疣孢菌FIM06031的發(fā)酵菌絲體提取液中分離到三個(gè)化合物(1～3)。通過波譜方法鑒定其中一個(gè)化合物harrucomicin C(1)為新倍半萜，另外兩個(gè)已知化合物為cyperusol C(2)和Nb-乙酰色胺(3)?；钚匝芯勘砻鱤arrucomicin C對(duì)腫瘤細(xì)胞株HepG2、EC109和HeLa具顯著增殖抑制活性，其IC50值分別為16.99、25.33 μM和34.64 μM;cyperusol C對(duì)腫瘤細(xì)胞HeLa和HepG2增殖抑制作用的IC50值分別為149.99 μM和167.78 μM。

疣孢菌;細(xì)胞毒活性;Harrucomicin C;倍半萜;Cyperusol C

長(zhǎng)期以來(lái)鏈霉菌是篩選抗腫瘤藥物的主要來(lái)源菌［1-3］，但隨著大多數(shù)鏈霉菌菌株被反復(fù)研究，從中發(fā)現(xiàn)新藥物的機(jī)率在逐漸降低，因而，人們把開發(fā)新菌源作為尋找新抗腫瘤藥物的重要突破口。海洋環(huán)境特殊，海洋放線菌產(chǎn)生的抗生素具有結(jié)構(gòu)多樣及活性獨(dú)特的特點(diǎn)［4-6］。

疣孢菌(Verrucosispora)屬于放線菌目小單孢菌科(Micromonosporaceae)。目前分離到的該屬菌種較少，對(duì)疣孢菌次生代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道更少，已報(bào)道的該屬三個(gè)菌株分別產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的抗菌化合物abyssomicin C［7］、抗腫瘤化合物proximicins A-C［8］和雄激素拮抗劑gifhornenolones A-B［9］。

我們采取選擇性分離方法從福建莆田平海海域的海綿中，分離到幾十株放線菌，基于16S rRNA基因序列的分子分類鑒別這些菌株屬于疣孢菌屬，選取其中一株初篩具顯著抑制腫瘤細(xì)胞作用的疣孢菌FIM06031為研究對(duì)象，研究其腫瘤細(xì)胞毒活性代謝產(chǎn)物。從FIM06031的發(fā)酵菌絲體提取液中分離得到三個(gè)化合物(1～3)，包括一個(gè)新倍半萜harrucomicin C(1)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞株HepG2，EC109和HeLa具顯著增殖抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器材料

Beckman J-20xp離心機(jī);硅膠GF254薄層層析板(青島海洋化工廠);柱層析用硅膠(100～200目);凝膠Sephadex LH-20(Phammacia);反相硅膠RP-18 (Merck);API QSTAR Pulsar i System質(zhì)譜儀;Bruker AV-400超導(dǎo)核磁共振波譜儀(TMS作為內(nèi)標(biāo)，δ為ppm，J為Hz);所用試劑均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞株

疣孢菌FIM06031，福建省微生物研究所菌種資源庫(kù)保存，作為專利菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏中心，編號(hào):CGMCC NO.3924。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株HepG2(肝癌細(xì)胞)、EC109(食管癌細(xì)胞)和HeLa(宮頸癌細(xì)胞)由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，均為國(guó)際通用的腫瘤細(xì)胞株。

1.1.3 種子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(%):可溶性淀粉1.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，MgSO4·7H2O 0.05，NaCl 0.05，(NH4)2SO40.05，CaCO30.1，自來(lái)水配制，pH 7.8(滅菌前)。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(%):可溶性淀粉4.0，葡萄糖0.5，黃豆餅粉 2.5，酵母粉 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO40.05，CaCO30.1，50%陳海水配制，pH 7.8(滅菌前)。

1.2 方法

1.2.1 菌株FIM06031的發(fā)酵

取一鉑環(huán)菌株FIM06031淀粉天冬素瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，35℃，240 rpm/min培養(yǎng)45 h;10%移種量轉(zhuǎn)入30 L發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，240 rpm/min振蕩培養(yǎng)96～120 h。

1.2.2 成分的提取

FIM06031菌株發(fā)酵液(30 L)4500 rpm/min離心15 min后獲得的菌絲體用95%乙醇(10 L)浸泡1 d，浸泡液減壓濃縮去除乙醇。濃縮液用乙酸乙酯(6 L)萃取，減壓濃縮得膏狀提取物(13.5 g)。

1.2.3 化合物的分離和純化

膏狀提取物(13.5 g)行正相硅膠柱層析，洗脫劑采用環(huán)己烷∶丙酮=2∶1，分段收集洗脫液。硅膠薄層層析(TLC)(二氯甲烷∶甲醇=5∶1)檢測(cè)，硫酸-乙醇(5∶95)顯色，105℃烘烤，合并相同組份，得到組份A(2.9 g)和組份B(2.5 g);組份A行反相C18色譜柱層析(甲醇∶水=50∶100)，分段收集洗脫液，合并相同組份，得到組份A1(0.7 g);A1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，合并得到組份A11(0.4 g);A11經(jīng)正相硅膠柱層析，洗脫劑采用石油醚∶丙酮=1∶1，分段收集洗脫液，TLC檢測(cè)，在Rf值約0.6左右處有粉紅色轉(zhuǎn)黑色斑點(diǎn)，合并獲得化合物1(3 mg)，在Rf值約0.4左右處有粉紅色轉(zhuǎn)黑色斑點(diǎn)，合并獲得化合物2(4 mg);組份B(2.5 g)經(jīng)反相C18色譜柱層析(甲醇∶水=75∶100)，分段收集洗脫液，合并得到組份B1(0.6 g);B1行正相硅膠柱層析，洗脫劑采用石油醚∶丙酮=3∶1，分段收集洗脫液，TLC檢測(cè)，在Rf值約0.7左右處有黃色斑點(diǎn)，合并獲得化合物3(8 mg)。

1.2.4 MTT法［10］測(cè)定化合物細(xì)胞毒活性

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2(肝癌細(xì)胞)、EC109(食管癌細(xì)胞)和HeLa(宮頸癌細(xì)胞)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105～4×105個(gè)/mL，取100 μL接種于96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸凈，每孔加入100 μL相應(yīng)濃度的含藥物的培養(yǎng)液，每一樣品設(shè)三平行組，同時(shí)設(shè)空白，陽(yáng)性對(duì)照為氟尿嘧啶(5-氟-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，加入MTT液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)孵育3～4 h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(λ=570 nm)上測(cè)定各孔的光吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過正相硅膠、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20和反相C18柱層析，共分離到3個(gè)化合物，根據(jù)NMR以及MS數(shù)據(jù)分別鑒定為harrucomicin C(1)、cyperusol C(2)和Nb-乙酰色胺(3)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1:

圖1 化合物1～3的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-3

化合物1 白色無(wú)定形粉末。溶于甲醇，丙酮，乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。［α］23D+14.2(c 0.2，MeOH);HR-ESI-MS m/z:379.2249［M+Na］+(calcd for 379.2351)，確定分子式為C23H32O3，計(jì)算其不飽和度為8。1H NMR(CD3OD，400 MHz)，在低場(chǎng)區(qū)顯示有5個(gè)芳環(huán)質(zhì)子信號(hào)δ:7.27(5H，m)，同時(shí)碳譜中6個(gè)信號(hào)δ:135.9(s)，130.4(d，×2)，129.5(d，×2)，128.1(d)，進(jìn)一步證實(shí)了單取代苯環(huán)的存在。比較化合物1和已知化合物cyperusol C (2)的1H及13C NMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，1除多出一個(gè)單取代的苯環(huán)信號(hào)外，在氫譜上多了一個(gè)亞甲基氫信號(hào)δ 3.61(2H，s)，在碳譜上多了兩個(gè)碳信號(hào)δ 173.3和δ 42.6。分析HSQC圖譜，發(fā)現(xiàn)δ 3.61(2H，s)與δ 42.6相關(guān)，HMBC圖譜中δ 3.61(2H，s，H-2')質(zhì)子信號(hào)與δ 173.3(C-1')、δ 135.9(C-3')和δ 130.4 (C-4')碳信號(hào)相關(guān)，結(jié)合分子式推測(cè)1可能比2多了一個(gè)苯乙?；１容^兩個(gè)化合物的氫譜，發(fā)現(xiàn)1中H-1位質(zhì)子信號(hào)(δ 4.51)與化合物2(δ 3.23，H-1)的化學(xué)位移相差較大，推測(cè)苯乙?；赡苓B在C-1位羥基上。HMBC圖譜中δ 4.51(H-1)與δ 173.3 (C-1')的相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了這一推斷，化合物1的平面結(jié)構(gòu)由此確定。

1的相對(duì)構(gòu)型通過ROESY圖譜確定，在ROESY圖譜中可以看到信號(hào)H-1與Hα-3、H-5相關(guān)，H-5與H-7相關(guān)，H-14與H-15相關(guān)。與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)對(duì)比進(jìn)一步驗(yàn)證了化合物1的相對(duì)構(gòu)型(見圖1)。經(jīng)SciFinder和INSPEC等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，表明這是一個(gè)新的化合物，命名為harrucomicin C。主要二維相關(guān)見圖2。并對(duì)其核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ: 4.51(1H，dd，J=10.4，4.8 Hz，H-1)，1.68(1H，m，Hα-2)，1.62(1H，m，Hβ-2)，1.75(1H，ddd，J= 12.0，3.5，3.0，Hz，Hβ-3)，1.57(1H，ddd，J=13.5，12.0，3.5 Hz，Hα-3)，1.36(1H，m，H-5)，1.86(1H，m，Hα-6)，1.22(1H，m，Hβ-6)，1.88(1H，m，H-7)，1.45(1H，m，Hα-8)，1.30(1H，dddd，J=17.0，13.5，13.0，3.5 Hz，Hβ-8)，1.43(1H，ddd，J=13.5，3.5，3.5 Hz，Hβ-9)，1.04(1H，ddd，J=13.5，13.0，4.0 Hz，Hα-9)，4.69(2H，d，J=6.5 Hz，H-12)，1.71 (3H，s，H-13)，0.90(3H，s，H-14)，1.08(3H，s，H-15)，3.61(2H，s，H-2')，7.27(5H，m，H-3'-8');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:82.9(d，C-1)，26.1(t，C-2)，41.3(t，C-3)，72.0(s，C-4)，54.2(d，C-5)， 26.8(t，C-6)，47.2(d，C-7)，27.5(t，C-8)，41.6 (t，C-9)，39.5(s，C-10)，151.6(s，C-11)，108.9 (t，C-12)，21.1(q，C-13)，14.5(q，C-14)，22.5 (q，C-15)，173.3(s，C-1')，42.6(t，C-2')，135.9 (s，C-3')，130.4(d，C-4')，129.5(d，C-5')，128.1 (d，C-6')，129.5(d，C-7')，130.4(d，C-8')。

圖2 Harrucomicin C的主要1H-1H COSY，HMBC和ROESY相關(guān)Fig.2 Key1H-1H COSY，HMBC and ROESY correlations for Harrucomicin C

化合物2 無(wú)色油狀物。溶于甲醇，丙酮，乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。［α–31.5(c 1.0，MeOH) APCI-MS(大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜)m/z:238.5［M］+。HR-EI-MS m/z:238.1934［M］+(calcd for 238.1933)確定分子式為 C15H26O2。1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:3.23(1H，dd，J=11.2，4.4 Hz，H-1)，1.64(2H，m，H-2)，1.72(1H，ddd，J= 12.0，3.5，3.0 Hz，Hβ-3)，1.52(1H，ddd，J=13.5，12.0，3.5 Hz，Hα-3)，1.28(1H，m，H-5)，1.86(1H，m，Hα-6)，1.24(1H，m，Hβ-6)，1.90(1H，m，H-7)，1.56(1H，m，Hα-8)，1.38(1H，dddd，J=17.0，13.5，13.0，3.5 Hz，Hβ-8)，1.94(1H，ddd，J=13.5，3.5，3.5 Hz，Hβ-9)，1.13(1H，ddd，J=13.5，13.0，4.0 Hz，Hα-9)，4.69(2H，m，H-12)，1.74(3H，s，H-13)，0.88(3H，s，H-14)，1.08(3H，s，H-15);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:80.3(d，C-1)，29.4(t，C-2)，41.9(t，C-3)，72.4(s，C-4)，54.1(d，C-5)，27.1(t，C-6)，47.5(d，C-7)，27.8(t，C-8)，42.0 (t，C-9)，40.3(s，C-10)，151.8(s，C-11)，108.9 (t，C-12)，21.2(q，C-13)，13.8(q，C-14)，22.6 (q，C-15)?；衔?的相對(duì)構(gòu)型通過ROESY圖譜確定，在ROESY圖譜中可以看到信號(hào)H-1與H-3、H-5相關(guān)，H-5與H-7相關(guān)，H-14與H-15相關(guān)。通過與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)對(duì)比進(jìn)一步驗(yàn)證了化合物2為cyperusol C。

化合物3 淡黃色油狀物。UV λmax(MeOH) nm:218，280。ESI-MS m/z:203［M+H］+，225［M +Na］+結(jié)合氫譜和碳譜確定分子式為 C12H14N2O。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:8.14(1H，brs，NH-1)，7.04(1H，d，J=2.2 Hz，H-2)，7.60(1H，d，J=8.0 Hz，H-4)，7.13(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-5)，7.21(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-6)，7.38(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，2.98(2H，t，J=6.5 Hz，H-10)，3.60(2H，dt，J=6.5，6.0 Hz，H-11)，5.53(1H，brs，NH-12)，1.92(3H，s，H-14);13CNMR (CD3OD，100 MHz)δ:122.3(d，C-2)，113.3(s，C-3)，119.2(d，C-4)，119.6(d，C-5)，123.3(d，C-6)，112.2(d，C-7)，138.2(s，C-8)，128.8(s，C-9)，26.2(t，C-10)，41.5(t，C-11)，173.2(s，C-13)，22.6(q，C-14)。與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)對(duì)比進(jìn)一步確定了化合物3為Nb-乙酰色胺。

2.2 細(xì)胞毒活性

Harrucomicin C(1)對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2，EC109和HeLa具有顯著增殖抑制活性，其IC50值分別為16.99 μM、25.33 μM和34.64 μM;cyperusol C(2)對(duì)腫瘤細(xì)胞HeLa和HepG2也具增殖抑制活性，其IC50值分別為149.99 μM和167.78 μM。

2.3 討論

從海綿共附生疣孢菌FIM06031的發(fā)酵菌絲體提取液中分離到三個(gè)代謝產(chǎn)物harrucomicin C，cyperusol C和Nb-乙酰色胺。其中harrucomicin C為新的具有顯著腫瘤細(xì)胞增值抑制活性的倍半萜，對(duì)其作用機(jī)理值得進(jìn)一步的研究，同時(shí)預(yù)示疣孢菌是產(chǎn)生新生物活性次生代謝產(chǎn)物的重要菌株來(lái)源，值得進(jìn)一步的研究。由于疣孢菌FIM06031的發(fā)酵菌絲體中harrucomicin C含量微量，樣品制備困難，發(fā)酵條件值得進(jìn)一步優(yōu)化。Cyperusol C是2004年Xu FM等［11］首次從中藥Cyperus longus中分離到，2010年Shirai M等［9］從一株疣孢菌中也分離到該化合物;Nb-乙酰色胺是2003年Li Y等［12］從海綿共附生的真菌中分離到。

1 Zang X(臧旭)，Huang M(黃敏).Advances in studies of antitumor metabolites from marine microorganisms.Chin J Microecol(中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志)，2010，22:949-953.

2 Peng JL(彭建柳)，Chen Y(陳育)，Yuan XZ(袁學(xué)丈).The study progress of anti-tumor activity substance for marine organisms.Int Med Health Guidance News(國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào))，2009，15:120-123.

3 Liu YL(劉燕蘭)，Xiao LH(肖麗華)，Wu M(吳敏)，et al.Advances in studies of antitumor metabolites from marine microorganisms.Guiding J Tradit Chin Med Pharm(中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào))，2007，13:114-116.

4 Fu JZ(傅俊曾)，Ji LX(冀蘭鑫)，Xie CF(謝春鋒).Biologically active natural products from Streptomyces microorganisms.Drug Eval Res(藥物評(píng)價(jià)研究)，2010，33:153-158.

5 Liu L(劉麗)，Hu JC(胡江春)，Wang SJ(王書錦).Progress in studies on bioactive metabolites of sponge associated microbes.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2004，16:477-481.

6 Prudhomme J，McDaniel E，Ponts N，et al.Marine actinomycetes:a new surce of compounds against the human malaria parasite.PLoS ONE，2008，3:2335-2338.

7 Fiedler HP，Bruntner C，Riedlinger J，et al.Proximicin A，B and C，novel aminofuran antibiotic and anticancer compounds isolated from marine strains of the actinomycete Verrucosispora.J Antibiot(Tokyo)，2008，61:158-163.

8 Riedlinger J，Reicke A，Zahner H，et al.Abyssomicins，inhibitors of the para-aminobenzoic acid pathway producedby the marine Verrucosispora strain AB-18-032.J Antibiot(Tokyo)，2004，57:271-279.

9 Shirai M，Okuda M，Motohashi K，et al.Terpenoids produced by actinomycetes:isolation，structural elucidation and biosynthesis of new diterpenes，gifhornenolones A and B from Verrucosispora gifhornensis YM28-088.J Antibiot(Tokyo)，2010，63:245-250.

10 Furukawa S.In vitro chemosensitivity of hepatocellular carcinoma for hepatic arterial infusion chemotherapy using the MTT assay with the combinations of antitumor drugs.Kurume Med J，2004，51:25-33.

11 Xu FM，Morikawa T，Matsuda H，et al.Structures of new sesquiterpenes and hepatoprotective constituents from the egyptian herbal medicine cyperus longus.J Nat prod，2004，67: 569-576.

12 Li Y，Li XF，Kim DS，et al.Indolyl alkaloid derivatives，Nbacetyltryptamine and oxaline from a marine-derived fungus.Arch Pharm Res，2003，26:21-23.

Novel Secondary Metabolites with Cytotoxic Activities Produced by Verrucosispora sp.FIM06031 from Marine Sponge

NIE Yi-lei1，WANG Chuan-xi1，ZHENG Yong-biao2，LIN Ru1，XU Li-yan3，PENG Fei1，F(xiàn)ANG Dong-sheng1，LIAN Yun-yang1，JIANG Hong1*1Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，F(xiàn)ujian institute of microbiology，F(xiàn)uzhou 350007，china;2Life sciences College of Fujian Normal Univesity，F(xiàn)uzhou 350108，china;3Shantou University Medical College，Shantou 515041，china

Three compounds(1-3)were isolated from culture broth of Verrucosispora sp.FIM06031 from marine sponge by silica gel，sephadex LH-20 and C18reversed phase column chromatography.On the basis of spectral data，they were identified as a novel sesquiterpenoid harrucomicin C(1)，cyperusol C(2)，and Nb-acetyltryptamine(3).Compound 1 showed prominent growth inhibitory activity against the tumor cell lines HepG2，EC109 and HeLa with IC50values of 16.99，25.33 μM and 34.64 μM，respectivity in vitro by MTT assay，while 2 showed growth inhibitory activity against HeLa and HepG2 cells with IC50values of 149.99 μM and 167.78 μM，respectively.

Verrucosispora;cytotoxic activity;harrucomicin C;sesquiterpenoid;cyperusol C

1001-6880(2011)05-0797-04

2011-04-20 接受日期:2011-07-29

國(guó)家“十一五”重大專項(xiàng)(2010ZX09401-403);福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011J01092);福建省重點(diǎn)項(xiàng)目(2009R10003-1)

*通訊作者 Tel:86-591-83475544;E-mail:jianghong709@yahoo.com.cn

R284.2

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