聯(lián)合磁性微球和基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜篩選腎細(xì)胞癌血清差異蛋白

柳金順，李漢忠，張玉石，王 澎，嚴(yán)維剛，謝 靜，董德鑫

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1泌尿外科 2中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

·論著·

聯(lián)合磁性微球和基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜篩選腎細(xì)胞癌血清差異蛋白

柳金順1，李漢忠1，張玉石1，王 澎2，嚴(yán)維剛1，謝 靜2，董德鑫1

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1泌尿外科2中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

目的采用聯(lián)合磁性微球和基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間(MALDI-TOF-MS)技術(shù)篩選腎細(xì)胞癌患者血清差異蛋白峰。方法采用弱陽(yáng)離子磁性微球從99份血清標(biāo)本(腎細(xì)胞癌62份，腎臟良性占位病變37份)捕獲血清蛋白，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀檢測(cè)蛋白峰，Biomarker Wizard 3.1和Biomarker Patterns Software 5.0分析數(shù)據(jù)，以47例腎細(xì)胞癌及26例腎臟良性占位病變標(biāo)本建立腎細(xì)胞癌診斷模型，15例腎細(xì)胞癌和11例腎臟良性占位病變標(biāo)本進(jìn)行盲法驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)蛋白峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，以質(zhì)荷比2945.35 、15340.8、6984.51、5819.23的4個(gè)蛋白峰建立腎細(xì)胞癌診斷模型，該模型區(qū)分腎細(xì)胞癌與腎臟良性占位病變的敏感性為83.0%，特異性為84.6%；盲法驗(yàn)證，該模型診斷腎細(xì)胞癌的敏感性為80.0%，特異性為81.8%。結(jié)論采用磁性微球與MALDI-TOF-MS技術(shù)可以檢測(cè)腎細(xì)胞癌血清中的差異蛋白峰，并建立敏感性、特異性較高的腎細(xì)胞癌診斷模型。

腎細(xì)胞癌；磁性微球；基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤[1]。早期腎細(xì)胞癌常無(wú)任何臨床癥狀，出現(xiàn)血尿、腰痛和腹部腫塊等腎癌三聯(lián)征時(shí)，往往已到晚期，預(yù)后較差，轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌5年存活率低于10%[2]。目前臨床上沒有理想的腎細(xì)胞癌特異性標(biāo)志物。表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)是一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，由蛋白質(zhì)芯片、質(zhì)譜儀和芯片分析軟件3部分組成，已廣泛用于腫瘤標(biāo)志物研究，也被應(yīng)用于腎癌血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域[3-7]。本研究采用磁性微球聯(lián)合基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)檢測(cè)腎細(xì)胞癌、腎臟良性占位病變患者血清，尋找差異蛋白峰，以期為下一步差異蛋白質(zhì)鑒定、尋找腎細(xì)胞癌生物標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

材料弱陽(yáng)離子(weak cation exchange，WCX)磁性微球購(gòu)自北京賽爾迪生物技術(shù)有限公司，乙腈、三氟乙酸、尿素、4羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、水(HPLC級(jí))、Tris堿、3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DDT) 、芥子酸(SPA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PBSⅡC?蛋白質(zhì)芯片閱讀儀為美國(guó)Ciphergen公司產(chǎn)品。

標(biāo)本來(lái)源及采集血清標(biāo)本取自2007年11月至2008年10月在北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科收治的腎細(xì)胞癌及腎臟良性占位病變患者，其中，腎細(xì)胞癌62例(腎細(xì)胞癌組)，男44例，女18例，平均年齡(52.7±10.6)歲(36～72歲)；透明細(xì)胞癌60例，乳頭狀癌2例，均經(jīng)病理證實(shí)；腫瘤分期(2002年AJCC腎癌TNM分期)：Ⅰ期41例，Ⅱ期9例，Ⅲ期8例，Ⅳ期4例。腎臟良性占位病變37例(對(duì)照組)，男21例，女16例，平均年齡(45.3±11.2)歲(34～76歲)；腎囊腫25例，腎血管平滑肌脂肪瘤12例，均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者于術(shù)前3d或以上清晨空腹采靜脈血2～3 ml，4℃冰箱保存，2 h內(nèi)處理血標(biāo)本。血清3000 g離心15 min，小心吸取上清分裝入eppendorf管，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)本準(zhǔn)備自-80℃冰箱取出備用的血清，冰浴融化，取5 μl加入含10 μl U9 裂解液(9mol/L 尿素，2%CHAPS，50mmol/L Tris-HCl，pH 9.0)，充分混勻；室溫下靜置30 min；加入100 mmol/L NaAC(pH 4.0)185 μl，盡快混勻。

弱陽(yáng)離子磁性微球的活化50 μl WCX磁性微珠加入PCR管中，置于磁力架上1 min，棄上清，加入NaAC 100 μl活化2次，每次5 min。

活化的磁性微球捕獲血清蛋白每份棄上清液活化的磁性微球中加入100 μl處理好的血清樣品，混勻后室溫下孵育30 min，置磁力架上分離，棄上清液，加100 μl NaAC洗滌2次，加入10 μl洗脫液(1%TFA)，吹打混勻，反應(yīng)2 min；置磁力架分離，取蛋白洗脫液5 μl，加入5 μl SPA飽和溶液，混勻后取2.5 μl混合液上樣到Au Chip 上，室溫風(fēng)干。采用PBSⅡC蛋白質(zhì)芯片閱讀儀讀取芯片，收集數(shù)據(jù)。

軟件設(shè)定芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)定相對(duì)分子質(zhì)量范圍為1000～50 000，選擇3個(gè)內(nèi)標(biāo)峰進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量校正，內(nèi)標(biāo)相對(duì)分子質(zhì)量為：3958、5905、7989。采用 Biomarker WizardTM3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，設(shè)定BPS識(shí)別蛋白峰的參數(shù)：First Pass: 5 S/N；Second Pass: 2 S/N；Cluster Mass window:0.3%；Min Peak Treshold: 5%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0軟件，組間比較行t檢驗(yàn)或Mann-Whitney秩檢驗(yàn)(偏態(tài)分布數(shù)據(jù))，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。把差異蛋白峰代入Biomarker PatternsTMSoftware (BPS) 5.0軟件，73例標(biāo)本建立診斷模型，采用盲法對(duì)未知的26例標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié) 果

差異蛋白峰篩查結(jié)果采用73例標(biāo)本(腎細(xì)胞癌組47例，對(duì)照組26例)檢測(cè)結(jié)果篩查兩組的差異蛋白峰，發(fā)現(xiàn)m/z 2945.35、5819.23、6984.51、7573.82、7943.42、15144.2、15340.8等7個(gè)蛋白峰在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

建立診斷模型采用Biomarker PatternsTMSoftware (BPS) 5.0軟件在這些差異蛋白峰中優(yōu)化選擇m/z 2945.35、15340.8、6984.51、5819.23 蛋白峰建立腎細(xì)胞癌診斷模型(圖1)，其蛋白峰值分別為4.88059、1.36466、1.20711、0.486689。該模型診斷腎細(xì)胞癌的敏感性為83.0%(39/47)，特異性為84.6%(22/26)。其中，m/z 2945.35、15340.8、5819.23蛋白在腎細(xì)胞癌組高表達(dá)，m/z 6984.51蛋白在腎細(xì)胞癌組低表達(dá)(圖2～5)。

診斷模型盲法驗(yàn)證將未經(jīng)過模型識(shí)別的15例腎細(xì)胞癌和11例腎臟良性占位病變檢測(cè)結(jié)果代入診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證，診斷腎細(xì)胞癌的敏感性為80.0%(12/15)，特異性為81.8%(9/11)。

表 1 腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組差異蛋白峰

RCC:腎細(xì)胞癌

RCC：renal cell carcinoma

RCC：腎細(xì)胞癌RCC: renal cell carcinoma

圖 2 m/z 2945.35差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組高表達(dá)Fig 2 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 2945.35 was overexpressed in RCC group

圖 3 m/z 5819.23差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組高表達(dá)Fig 3 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 5918.23 was overexpressed in RCC group

圖 4 m/z 6984.51差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組低表達(dá)Fig 4 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 6984.51 was underexpressed in RCC group

圖 5 m/z 15 340.8差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組高表達(dá)Fig 5 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 15 340.8 was overexpressed in RCC group

討 論

磁性微球，也稱為磁珠，是直徑小于100 nm的單晶體或多晶體，由磁性粒與各種高分子骨架材料制備而成。磁性微球表面可以外被多種具有生物活性的官能團(tuán)，能共價(jià)結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)，利用外部磁場(chǎng)進(jìn)行分離。磁珠檢測(cè)樣品超小體積(只要0.5 μl)即可，不需做特殊前處理，直接點(diǎn)樣檢測(cè)；分離過程不需要對(duì)混合溶液的pH值、溫度、離子強(qiáng)度等進(jìn)行調(diào)整，從而避免了傳統(tǒng)分離過程中的蛋白質(zhì)損失，具有快速、高純、高收率等優(yōu)點(diǎn)[8]；而且具有表面效應(yīng)和體積效應(yīng)，比表面積激增，官能團(tuán)密度和選擇性吸附能力增大，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)[9]?；诖判晕⑶蛞陨系膬?yōu)點(diǎn)，本研究采用這種技術(shù)分離腎細(xì)胞癌患者血清中的蛋白質(zhì)，并聯(lián)合MALDI-TOF-MS 技術(shù)進(jìn)行質(zhì)譜分析，其基本原理與SELDI-TOF-MS類似。這種組合已被應(yīng)用于直腸癌、頭頸部腫瘤等領(lǐng)域的研究[10-12]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程必然伴隨著細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)類型、數(shù)量上的變化，這些蛋白質(zhì)、分解肽段或其代謝產(chǎn)物可能會(huì)釋放入血，比較腫瘤與正常健康人群/良性病變血清差異蛋白譜，可能篩選出對(duì)腫瘤具有診斷意義的指標(biāo)。本研究采用弱陽(yáng)離子磁性微球聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)比較腎細(xì)胞癌、腎臟良性占位病變患者血清蛋白，尋找差異蛋白峰，結(jié)果在兩組中發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異蛋白峰，經(jīng)過BPS軟件智能選擇，有4個(gè)蛋白峰進(jìn)入診斷模型，其中3個(gè)蛋白峰在腎細(xì)胞癌組有高表達(dá)，1個(gè)蛋白峰低表達(dá)。特別是m/z 2945.35、m/z 15340.8這兩個(gè)蛋白峰，只要m/z 2945.35蛋白峰強(qiáng)度>4.88059就可以判斷出12/47例腎細(xì)胞癌，m/z 15340.8蛋白峰強(qiáng)度> 1.36466可以判斷出6/47例腎細(xì)胞癌。這兩個(gè)蛋白峰有成為腫瘤標(biāo)記物的潛力，值得進(jìn)一步鑒定、驗(yàn)證。m/z 6984.51蛋白峰在腎細(xì)胞癌組低表達(dá)，提示該蛋白的低表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，對(duì)于了解腎腫瘤的機(jī)制有一定意義。雖然目前無(wú)法明確差異蛋白的性質(zhì)，采用已經(jīng)建立的診斷模型，診斷未知的標(biāo)本具有較高的敏感性、特異性。

Tolson等[3]采用SELDI-TOF-MS技術(shù)研究腎癌患者血清，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為9200和1683兩個(gè)標(biāo)志物，經(jīng)過進(jìn)一步鑒定，分別為α-1結(jié)合珠蛋白(haptoglobin alpha 1，Hptα-1)和血清淀粉樣蛋白的異構(gòu)體(serum amyloid A1，SAA-1)。Engwegen等[4]發(fā)現(xiàn)SAA波峰可以出現(xiàn)在腎癌早期、晚期、術(shù)前、術(shù)后；但后來(lái)的研究提示Hptα-1、SAA-1不是腎癌的特異性蛋白，Hptα-1可出現(xiàn)在卵巢癌患者血清中，SAA-1在卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌血清中被發(fā)現(xiàn)[13]。上述研究比較的是腎癌、健康人群之間的差異蛋白峰，結(jié)果可能是腫瘤的非特異性蛋白，并非腎癌所特有的。本研究比較腎細(xì)胞癌、腎臟良性占位病變之間的差異，可以消除一部分非特異性的差異蛋白峰，結(jié)果顯示在這兩個(gè)蛋白峰附近，腎細(xì)胞癌組與腎臟良性占位病變組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于各種腫瘤蛋白理化性質(zhì)不同，部分腎癌組織發(fā)現(xiàn)的差異蛋白可能無(wú)法滲入或分泌入血清，在血清中無(wú)法檢測(cè)到。Holcakova等[5]在組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)腎癌中相對(duì)分子質(zhì)量為20 165 的差異蛋白，鑒定為α-晶狀體蛋白B，采用SELDI-TOF-MS檢測(cè)同一人群的血清，在相對(duì)分子質(zhì)量 20 165 附近無(wú)法檢測(cè)到蛋白峰。本研究在相對(duì)分子質(zhì)量 20 165 附近也沒有檢測(cè)到蛋白峰。

本研究中標(biāo)準(zhǔn)差較大，提示數(shù)據(jù)離散較大，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)P>0.05，說(shuō)明數(shù)據(jù)是符合正態(tài)分布的。這與MALDI-TOF-MS技術(shù)的缺點(diǎn)有關(guān)，它是一種半定量技術(shù)，蛋白峰高度只是相對(duì)于捕獲的蛋白豐度，而不是真正血清蛋白濃度。另外，無(wú)論使用芯片或者磁珠，不能捕獲所有性質(zhì)相同的蛋白質(zhì)；不能直接測(cè)定蛋白質(zhì)序列，不能給出c端、N端和蛋白質(zhì)構(gòu)型等一些重要信息。蛋白質(zhì)的鑒定需要通過經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段。

[1] 吳階平. 吳階平泌尿外科學(xué)[M]. 山東:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2004:888-917.

[2] Banks RE, Craven RA, Harnden P, et al. Key clinical issues in renal cancer: a challenge for proteomics[J]. World J Urol, 2007, 25(6):537-556.

[3] Tolson J, Bogumil R, Brunst E, et al. Serum protein profiling by SELDI mass spectrometry: detection of multiple variants of serum amyloid alpha in renal cancer patients[J]. Lab Invest, 2004, 84(7):845-856.

[4] Engwegen JY, Mehra N, Haanen JB, et al. Validation of SELDI-TOF-MS serum protein profiles for renal cell carcinoma in new populations[J]. Lab Invest, 2007, 87(2):161-172.

[5] Holcakova J, Hernychova L, Bouchal P, et al. Identification of alphaB- crystallin, a biomarker of renal cell carcinoma by SELDI-TOF-MS[J]. Int J Biol Markers, 2008, 23(1):48-53.

[6] Jones J, Otu HH, Grall F, et al. Proteomic identification of interleukin-2 therapy response in metastatic renal cell cancer[J]. J Urol, 2008, 179(2):730-736.

[7] Nakamura K, Yoshikawa K, Yamada Y, et al. Differential profiling analysis of proteins involved in anti-proliferative effect of interferon-alpha on renal cell carcinoma cell lines by protein biochip technology[J]. Int J Oncol, 2006, 28(4):965-970.

[8] 王勝林, 王強(qiáng)斌,古宏晨, 等. 磁性微球的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)世界, 2001, 42(7):384-387.

[9] 趙慧君, 王德平,黃文旵, 等. 磁性納米微球的特性及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2003，24(4):288-291.

[10] Sparbier K, Asperger A, Resemann A, et al. Analysis of glycoproteins in human serum by means of glycospecific magnetic bead separation and LC-MALDI-TOF/TOF analysis with automated glycopeptide detection[J]. J Biomol Tech, 2007, 18(4):252-258.

[11] Ducoux-Petit M, Uttenweiler-Joseph S, Brichory F, et al. Scaled-down purification protocol to access proteomic analysis of 20S proteasome from human tissue samples: comparison of normal and tumor colorectal cells[J]. J Proteome Res, 2008, 7(7):2852-2859.

[12] Freed GL, Cazares LH, Fichandler CE, et al. Differential capture of serum proteins for expression profiling and biomarker discovery in pre- and posttreatment head and neck cancer samples[J]. Laryngoscope, 2008, 118(1):61-68.

[13] Engwegen JY, Gast MC, Schellens JH, et al. Clinical proteomics: searching for better tumour markers with SELDI-TOF mass spectrometry[J]. Trends Pharmacol Sci, 2006, 27(5):251-259.

ScreeningfortheSerumDifferentialProteinsofRenalCellCarcinomaUsingMagneticBeads-basedMatrix-assistedLaserDesorption/IonizationTime-of-flightMassSpectrometry

LIU Jin-shun1, LI Han-zhong1, ZHANG Yu-shi1, WANG Peng2,YAN Wei-gang1, XIE Jing2, DONG De-xin1

1Department of Urology,2Centre Laboratory, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

LI Han-zhong Tel: 010-65296035, E-mail: lihanzhong@medmail.com.cn

ObjectiveTo screen for the differential protein peaks of renal cell carcinoma (RCC) using magnetic beads-based matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).MethodsSerum proteins were profiled by magnetic beads (WCX) from 62 RCC patients and 37 patients with benign renal space-occupying lesions. Protein peaks were identified by MALDI-TOF-MS. Data were analyzed with Biomarker Wizard 3.1 and Biomarker Patterns Software 5.0. Diagnostic model for RCC was constructed based on 47 RCC cases and 26 patients with benign renal space-occupying lesions. The remaining 26 cases were evaluated with blind method.ResultsSeven differential protein peaks related to RCC were identified (P<0.05). The diagnostic model for RCC constructed by the differential protein peaks (m/z2945.35, 15340.8, 6984.51, and 5819.23) generated excellent separation between the RCC and control groups, with a sensitivity of 83.0% and the specificity of 84.6%. As validated by blind method, the model had a sensitivity of 80.0 % and a specificity of 81.8%.ConclusionDifferential protein peaks for RCC can be identified in serum by magnetic beads-based MALDI-TOF-MS, which is also valuable for the establishment of a RCC diagnostic model with a high sensitivity and specificity.

renal cell carcinoma; magnetic beads; matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

ActaAcadMedSin，2011，33(3)：287-291

李漢忠 電話：010-65296035，電子郵件: lihanzhong@medmail.com.cn

R737.11

A

1000-503X(2011)03-0287-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.03.016

國(guó)家自然科學(xué)基金(30772165)和高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20070023069)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30772165)and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20070023069)

2010-07-02)