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      聯(lián)合磁性微球和基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜篩選腎細(xì)胞癌血清差異蛋白

      2011-11-23 05:10:40柳金順李漢忠張玉石嚴(yán)維剛董德鑫
      關(guān)鍵詞:診斷模型腎癌微球

      柳金順,李漢忠,張玉石,王 澎,嚴(yán)維剛,謝 靜,董德鑫

      中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1泌尿外科 2中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100730

      ·論著·

      聯(lián)合磁性微球和基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜篩選腎細(xì)胞癌血清差異蛋白

      柳金順1,李漢忠1,張玉石1,王 澎2,嚴(yán)維剛1,謝 靜2,董德鑫1

      中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院1泌尿外科2中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100730

      目的采用聯(lián)合磁性微球和基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間(MALDI-TOF-MS)技術(shù)篩選腎細(xì)胞癌患者血清差異蛋白峰。方法采用弱陽(yáng)離子磁性微球從99份血清標(biāo)本(腎細(xì)胞癌62份,腎臟良性占位病變37份)捕獲血清蛋白,MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀檢測(cè)蛋白峰,Biomarker Wizard 3.1和Biomarker Patterns Software 5.0分析數(shù)據(jù),以47例腎細(xì)胞癌及26例腎臟良性占位病變標(biāo)本建立腎細(xì)胞癌診斷模型,15例腎細(xì)胞癌和11例腎臟良性占位病變標(biāo)本進(jìn)行盲法驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)蛋白峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),以質(zhì)荷比2945.35 、15340.8、6984.51、5819.23的4個(gè)蛋白峰建立腎細(xì)胞癌診斷模型,該模型區(qū)分腎細(xì)胞癌與腎臟良性占位病變的敏感性為83.0%,特異性為84.6%;盲法驗(yàn)證,該模型診斷腎細(xì)胞癌的敏感性為80.0%,特異性為81.8%。結(jié)論采用磁性微球與MALDI-TOF-MS技術(shù)可以檢測(cè)腎細(xì)胞癌血清中的差異蛋白峰,并建立敏感性、特異性較高的腎細(xì)胞癌診斷模型。

      腎細(xì)胞癌;磁性微球;基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜

      腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤[1]。早期腎細(xì)胞癌常無(wú)任何臨床癥狀,出現(xiàn)血尿、腰痛和腹部腫塊等腎癌三聯(lián)征時(shí),往往已到晚期,預(yù)后較差,轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌5年存活率低于10%[2]。目前臨床上沒有理想的腎細(xì)胞癌特異性標(biāo)志物。表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)是一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),由蛋白質(zhì)芯片、質(zhì)譜儀和芯片分析軟件3部分組成,已廣泛用于腫瘤標(biāo)志物研究,也被應(yīng)用于腎癌血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域[3-7]。本研究采用磁性微球聯(lián)合基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)檢測(cè)腎細(xì)胞癌、腎臟良性占位病變患者血清,尋找差異蛋白峰,以期為下一步差異蛋白質(zhì)鑒定、尋找腎細(xì)胞癌生物標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ)。

      材料和方法

      材料弱陽(yáng)離子(weak cation exchange,WCX)磁性微球購(gòu)自北京賽爾迪生物技術(shù)有限公司,乙腈、三氟乙酸、尿素、4羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、水(HPLC級(jí))、Tris堿、3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DDT) 、芥子酸(SPA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,PBSⅡC?蛋白質(zhì)芯片閱讀儀為美國(guó)Ciphergen公司產(chǎn)品。

      標(biāo)本來(lái)源及采集血清標(biāo)本取自2007年11月至2008年10月在北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科收治的腎細(xì)胞癌及腎臟良性占位病變患者,其中,腎細(xì)胞癌62例(腎細(xì)胞癌組),男44例,女18例,平均年齡(52.7±10.6)歲(36~72歲);透明細(xì)胞癌60例,乳頭狀癌2例,均經(jīng)病理證實(shí);腫瘤分期(2002年AJCC腎癌TNM分期):Ⅰ期41例,Ⅱ期9例,Ⅲ期8例,Ⅳ期4例。腎臟良性占位病變37例(對(duì)照組),男21例,女16例,平均年齡(45.3±11.2)歲(34~76歲);腎囊腫25例,腎血管平滑肌脂肪瘤12例,均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者于術(shù)前3d或以上清晨空腹采靜脈血2~3 ml,4℃冰箱保存,2 h內(nèi)處理血標(biāo)本。血清3000 g離心15 min,小心吸取上清分裝入eppendorf管,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

      標(biāo)本準(zhǔn)備自-80℃冰箱取出備用的血清,冰浴融化,取5 μl加入含10 μl U9 裂解液(9mol/L 尿素,2%CHAPS,50mmol/L Tris-HCl,pH 9.0),充分混勻;室溫下靜置30 min;加入100 mmol/L NaAC(pH 4.0)185 μl,盡快混勻。

      弱陽(yáng)離子磁性微球的活化50 μl WCX磁性微珠加入PCR管中,置于磁力架上1 min,棄上清,加入NaAC 100 μl活化2次,每次5 min。

      活化的磁性微球捕獲血清蛋白每份棄上清液活化的磁性微球中加入100 μl處理好的血清樣品,混勻后室溫下孵育30 min,置磁力架上分離,棄上清液,加100 μl NaAC洗滌2次,加入10 μl洗脫液(1%TFA),吹打混勻,反應(yīng)2 min;置磁力架分離,取蛋白洗脫液5 μl,加入5 μl SPA飽和溶液,混勻后取2.5 μl混合液上樣到Au Chip 上,室溫風(fēng)干。采用PBSⅡC蛋白質(zhì)芯片閱讀儀讀取芯片,收集數(shù)據(jù)。

      軟件設(shè)定芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)定相對(duì)分子質(zhì)量范圍為1000~50 000,選擇3個(gè)內(nèi)標(biāo)峰進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量校正,內(nèi)標(biāo)相對(duì)分子質(zhì)量為:3958、5905、7989。采用 Biomarker WizardTM3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,設(shè)定BPS識(shí)別蛋白峰的參數(shù):First Pass: 5 S/N;Second Pass: 2 S/N;Cluster Mass window:0.3%;Min Peak Treshold: 5%。

      統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0軟件,組間比較行t檢驗(yàn)或Mann-Whitney秩檢驗(yàn)(偏態(tài)分布數(shù)據(jù)),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。把差異蛋白峰代入Biomarker PatternsTMSoftware (BPS) 5.0軟件,73例標(biāo)本建立診斷模型,采用盲法對(duì)未知的26例標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

      結(jié) 果

      差異蛋白峰篩查結(jié)果采用73例標(biāo)本(腎細(xì)胞癌組47例,對(duì)照組26例)檢測(cè)結(jié)果篩查兩組的差異蛋白峰,發(fā)現(xiàn)m/z 2945.35、5819.23、6984.51、7573.82、7943.42、15144.2、15340.8等7個(gè)蛋白峰在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

      建立診斷模型采用Biomarker PatternsTMSoftware (BPS) 5.0軟件在這些差異蛋白峰中優(yōu)化選擇m/z 2945.35、15340.8、6984.51、5819.23 蛋白峰建立腎細(xì)胞癌診斷模型(圖1),其蛋白峰值分別為4.88059、1.36466、1.20711、0.486689。該模型診斷腎細(xì)胞癌的敏感性為83.0%(39/47),特異性為84.6%(22/26)。其中,m/z 2945.35、15340.8、5819.23蛋白在腎細(xì)胞癌組高表達(dá),m/z 6984.51蛋白在腎細(xì)胞癌組低表達(dá)(圖2~5)。

      診斷模型盲法驗(yàn)證將未經(jīng)過模型識(shí)別的15例腎細(xì)胞癌和11例腎臟良性占位病變檢測(cè)結(jié)果代入診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證,診斷腎細(xì)胞癌的敏感性為80.0%(12/15),特異性為81.8%(9/11)。

      表 1 腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組差異蛋白峰

      RCC:腎細(xì)胞癌

      RCC:renal cell carcinoma

      RCC:腎細(xì)胞癌RCC: renal cell carcinoma

      圖 2 m/z 2945.35差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組高表達(dá)Fig 2 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 2945.35 was overexpressed in RCC group

      圖 3 m/z 5819.23差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組高表達(dá)Fig 3 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 5918.23 was overexpressed in RCC group

      圖 4 m/z 6984.51差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組低表達(dá)Fig 4 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 6984.51 was underexpressed in RCC group

      圖 5 m/z 15 340.8差異蛋白峰在腎細(xì)胞癌組與對(duì)照組的典型圖譜,在腎細(xì)胞癌組高表達(dá)Fig 5 Typical spectra of RCC and benign renal space-occupying lesion, the differential peak of m/z 15 340.8 was overexpressed in RCC group

      討 論

      磁性微球,也稱為磁珠,是直徑小于100 nm的單晶體或多晶體,由磁性粒與各種高分子骨架材料制備而成。磁性微球表面可以外被多種具有生物活性的官能團(tuán),能共價(jià)結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì),利用外部磁場(chǎng)進(jìn)行分離。磁珠檢測(cè)樣品超小體積(只要0.5 μl)即可,不需做特殊前處理,直接點(diǎn)樣檢測(cè);分離過程不需要對(duì)混合溶液的pH值、溫度、離子強(qiáng)度等進(jìn)行調(diào)整,從而避免了傳統(tǒng)分離過程中的蛋白質(zhì)損失,具有快速、高純、高收率等優(yōu)點(diǎn)[8];而且具有表面效應(yīng)和體積效應(yīng),比表面積激增,官能團(tuán)密度和選擇性吸附能力增大,可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)[9]?;诖判晕⑶蛞陨系膬?yōu)點(diǎn),本研究采用這種技術(shù)分離腎細(xì)胞癌患者血清中的蛋白質(zhì),并聯(lián)合MALDI-TOF-MS 技術(shù)進(jìn)行質(zhì)譜分析,其基本原理與SELDI-TOF-MS類似。這種組合已被應(yīng)用于直腸癌、頭頸部腫瘤等領(lǐng)域的研究[10-12]。

      腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程必然伴隨著細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)類型、數(shù)量上的變化,這些蛋白質(zhì)、分解肽段或其代謝產(chǎn)物可能會(huì)釋放入血,比較腫瘤與正常健康人群/良性病變血清差異蛋白譜,可能篩選出對(duì)腫瘤具有診斷意義的指標(biāo)。本研究采用弱陽(yáng)離子磁性微球聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)比較腎細(xì)胞癌、腎臟良性占位病變患者血清蛋白,尋找差異蛋白峰,結(jié)果在兩組中發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異蛋白峰,經(jīng)過BPS軟件智能選擇,有4個(gè)蛋白峰進(jìn)入診斷模型,其中3個(gè)蛋白峰在腎細(xì)胞癌組有高表達(dá),1個(gè)蛋白峰低表達(dá)。特別是m/z 2945.35、m/z 15340.8這兩個(gè)蛋白峰,只要m/z 2945.35蛋白峰強(qiáng)度>4.88059就可以判斷出12/47例腎細(xì)胞癌,m/z 15340.8蛋白峰強(qiáng)度> 1.36466可以判斷出6/47例腎細(xì)胞癌。這兩個(gè)蛋白峰有成為腫瘤標(biāo)記物的潛力,值得進(jìn)一步鑒定、驗(yàn)證。m/z 6984.51蛋白峰在腎細(xì)胞癌組低表達(dá),提示該蛋白的低表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展,對(duì)于了解腎腫瘤的機(jī)制有一定意義。雖然目前無(wú)法明確差異蛋白的性質(zhì),采用已經(jīng)建立的診斷模型,診斷未知的標(biāo)本具有較高的敏感性、特異性。

      Tolson等[3]采用SELDI-TOF-MS技術(shù)研究腎癌患者血清,發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為9200和1683兩個(gè)標(biāo)志物,經(jīng)過進(jìn)一步鑒定,分別為α-1結(jié)合珠蛋白(haptoglobin alpha 1,Hptα-1)和血清淀粉樣蛋白的異構(gòu)體(serum amyloid A1,SAA-1)。Engwegen等[4]發(fā)現(xiàn)SAA波峰可以出現(xiàn)在腎癌早期、晚期、術(shù)前、術(shù)后;但后來(lái)的研究提示Hptα-1、SAA-1不是腎癌的特異性蛋白,Hptα-1可出現(xiàn)在卵巢癌患者血清中,SAA-1在卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌血清中被發(fā)現(xiàn)[13]。上述研究比較的是腎癌、健康人群之間的差異蛋白峰,結(jié)果可能是腫瘤的非特異性蛋白,并非腎癌所特有的。本研究比較腎細(xì)胞癌、腎臟良性占位病變之間的差異,可以消除一部分非特異性的差異蛋白峰,結(jié)果顯示在這兩個(gè)蛋白峰附近,腎細(xì)胞癌組與腎臟良性占位病變組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于各種腫瘤蛋白理化性質(zhì)不同,部分腎癌組織發(fā)現(xiàn)的差異蛋白可能無(wú)法滲入或分泌入血清,在血清中無(wú)法檢測(cè)到。Holcakova等[5]在組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)腎癌中相對(duì)分子質(zhì)量為20 165 的差異蛋白,鑒定為α-晶狀體蛋白B,采用SELDI-TOF-MS檢測(cè)同一人群的血清,在相對(duì)分子質(zhì)量 20 165 附近無(wú)法檢測(cè)到蛋白峰。本研究在相對(duì)分子質(zhì)量 20 165 附近也沒有檢測(cè)到蛋白峰。

      本研究中標(biāo)準(zhǔn)差較大,提示數(shù)據(jù)離散較大,Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)P>0.05,說(shuō)明數(shù)據(jù)是符合正態(tài)分布的。這與MALDI-TOF-MS技術(shù)的缺點(diǎn)有關(guān),它是一種半定量技術(shù),蛋白峰高度只是相對(duì)于捕獲的蛋白豐度,而不是真正血清蛋白濃度。另外,無(wú)論使用芯片或者磁珠,不能捕獲所有性質(zhì)相同的蛋白質(zhì);不能直接測(cè)定蛋白質(zhì)序列,不能給出c端、N端和蛋白質(zhì)構(gòu)型等一些重要信息。蛋白質(zhì)的鑒定需要通過經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段。

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      ScreeningfortheSerumDifferentialProteinsofRenalCellCarcinomaUsingMagneticBeads-basedMatrix-assistedLaserDesorption/IonizationTime-of-flightMassSpectrometry

      LIU Jin-shun1, LI Han-zhong1, ZHANG Yu-shi1, WANG Peng2,YAN Wei-gang1, XIE Jing2, DONG De-xin1

      1Department of Urology,2Centre Laboratory, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

      LI Han-zhong Tel: 010-65296035, E-mail: lihanzhong@medmail.com.cn

      ObjectiveTo screen for the differential protein peaks of renal cell carcinoma (RCC) using magnetic beads-based matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).MethodsSerum proteins were profiled by magnetic beads (WCX) from 62 RCC patients and 37 patients with benign renal space-occupying lesions. Protein peaks were identified by MALDI-TOF-MS. Data were analyzed with Biomarker Wizard 3.1 and Biomarker Patterns Software 5.0. Diagnostic model for RCC was constructed based on 47 RCC cases and 26 patients with benign renal space-occupying lesions. The remaining 26 cases were evaluated with blind method.ResultsSeven differential protein peaks related to RCC were identified (P<0.05). The diagnostic model for RCC constructed by the differential protein peaks (m/z2945.35, 15340.8, 6984.51, and 5819.23) generated excellent separation between the RCC and control groups, with a sensitivity of 83.0% and the specificity of 84.6%. As validated by blind method, the model had a sensitivity of 80.0 % and a specificity of 81.8%.ConclusionDifferential protein peaks for RCC can be identified in serum by magnetic beads-based MALDI-TOF-MS, which is also valuable for the establishment of a RCC diagnostic model with a high sensitivity and specificity.

      renal cell carcinoma; magnetic beads; matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

      ActaAcadMedSin,2011,33(3):287-291

      李漢忠 電話:010-65296035,電子郵件: lihanzhong@medmail.com.cn

      R737.11

      A

      1000-503X(2011)03-0287-05

      10.3881/j.issn.1000-503X.2011.03.016

      國(guó)家自然科學(xué)基金(30772165)和高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20070023069)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30772165)and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20070023069)

      2010-07-02)

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