心理應(yīng)激對大鼠實驗性牙周炎及牙周組織中低氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)的影響*

張增方， 呂芳麗， 陳 瑩， 楊曉燕， 黃綺凌， 李東健， 黃世光△

(1 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系, 廣東 廣州 510632；2 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室， 中山大學(xué)熱帶病防治研究教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510080；3 廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科， 廣東 廣州 510120；4 廣州市荔灣區(qū)口腔醫(yī)院, 廣東 廣州 510170)

心理應(yīng)激對大鼠實驗性牙周炎及牙周組織中低氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)的影響*

張增方1,3， 呂芳麗2， 陳 瑩2， 楊曉燕2， 黃綺凌1， 李東健4， 黃世光1△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系, 廣東 廣州 510632；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室， 中山大學(xué)熱帶病防治研究教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510080；3廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科， 廣東 廣州 510120；4廣州市荔灣區(qū)口腔醫(yī)院, 廣東 廣州 510170)

目的探討心理應(yīng)激對牙周炎及其氧代謝的影響。方法建立大鼠實驗性牙周炎模型并予以應(yīng)激刺激，SPF級4 周齡雄性Wistar大鼠48只，隨機分為4組：(1)正常對照組；(2)實驗性牙周炎組：用浸有牙周致病菌的絲線結(jié)扎左側(cè)上頜第二磨牙牙頸部復(fù)制牙周炎模型；(3)單純應(yīng)激組：牙周不作特殊處理，給予應(yīng)激刺激；(4)牙周炎+應(yīng)激組：按上法復(fù)制牙周炎模型，并予以應(yīng)激刺激。各組動物分別于實驗后第1、4、6、8 周末分批處死，各時點每組處死的動物數(shù)為3只。大鼠處死前測量牙周附著喪失, 制作牙體牙周聯(lián)合切片觀察牙周的組織學(xué)改變；采用免疫組化法檢測各實驗組大鼠牙周組織低氧誘導(dǎo)因子 1α(HIF-1α)的表達(dá)水平，通過計算HIF-1α平均陽性細(xì)胞率來評估組織的缺氧程度。結(jié)果(1)與正常對照組比較，單純應(yīng)激組牙周附著喪失程度在各時點均無顯著差異(P>0.05)；(2)牙周炎+應(yīng)激組牙周附著喪失程度在4、6和8周時明顯高于牙周炎組(P<0.01)；(3)與正常對照組比較，單純應(yīng)激組HIF-1α平均陽性細(xì)胞率在各時點均無顯著差異(P>0.05)；(4)牙周炎+應(yīng)激組HIF-1α平均陽性細(xì)胞率在4、6和8周時顯著高于牙周炎組(P<0.01)。結(jié)論應(yīng)激刺激可能通過降低牙周組織氧代謝水平加重大鼠牙周炎癥程度。

牙周炎； 動物模型； 心理應(yīng)激； 低氧誘導(dǎo)因子1α

心理應(yīng)激與牙周健康狀況密切相關(guān)，可能是牙周炎的重要危險因素之一[1,2]。 目前關(guān)于心理應(yīng)激影響牙周炎機制的研究多集中在免疫及內(nèi)分泌等方面，其確切機制至今仍未闡明。有關(guān)心理應(yīng)激影響牙周組織氧代謝的機制，國內(nèi)外的研究較少涉及。氧代謝對牙周組織生理機能的維持起著非常重要的作用，牙周組織氧代謝變化對牙周炎癥發(fā)展可能起重要影響。低氧誘導(dǎo)因子 1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是細(xì)胞低氧適應(yīng)與應(yīng)答調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子[3,4]，HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)下表達(dá)增強，通過檢測HIF-1α蛋白在組織局部的表達(dá)情況可判斷組織的氧代謝情況。本文利用大鼠實驗性牙周炎的模型，觀察心理應(yīng)激對牙周炎及牙周組織中HIF-1α表達(dá)的影響，以了解應(yīng)激對牙周炎及其氧代謝的影響情況。

材 料 和 方 法

1材料

SPF級Wistar大鼠購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；大鼠HIF-1α的Ⅰ抗及Ⅱ抗免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

2方法

2.1實驗動物分組 SPF級4周齡雄性Wistar大鼠48只，體重約170-200 g，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實驗。大鼠按隨機數(shù)字表法分成4組，每組12只：(1) 正常對照組(control group)：動物正常喂養(yǎng)，牙周不作特殊處理；(2)實驗性牙周炎組(experimental periodontitis group)：用浸有牙周致病菌的3-0絲線結(jié)扎左側(cè)上頜第二磨牙牙頸部復(fù)制牙周炎模型；(3)單純應(yīng)激組(stress group)：牙周不作特殊處理，給予應(yīng)激刺激；(4)牙周炎+應(yīng)激組(periodontitis with stress group)：按上法復(fù)制牙周炎模型，并予以應(yīng)激刺激。各組動物分別于實驗后第1、4、6、8 周末分批處死，各時點每組處死動物數(shù)為3只。

2.2牙周致病菌絲線的制備 收集臨床確診為慢性牙周炎患者的牙周病變區(qū)域齦下菌斑，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸鹽溶液的小瓶中，充分混勻，以生理鹽水進行10倍系列稀釋，選擇稀釋度為10-3的濃度接種于CDC厭氧血瓊脂平板上，將3-0無菌絲線置于該瓊脂平板上，在厭養(yǎng)菌培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)5 d。

2.3牙周炎動物模型的建立 采用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，大鼠按每10 g體重注射麻藥0.1 mL。待動物麻醉失去知覺后，使之仰臥位，固定四肢及頭部，1%碘酊消毒口腔及口周，用70%乙醇脫碘，并以棉線牽拉固定上、下頜，使之呈大張口狀，絲線穿舌全層拉向一側(cè)。用尖探針分離左側(cè)上頜第2磨牙牙齦組織，用浸有牙周致病菌的3-0絲線纏繞牙頸部1圈，結(jié)扎絲線置于齦溝內(nèi)，于近中頰處打結(jié)。實驗后1周內(nèi)每天檢查結(jié)扎絲線，若結(jié)扎絲線出現(xiàn)松脫則及時重新結(jié)扎。

2.4應(yīng)激方案 采取3種應(yīng)激方案：(1)限制性應(yīng)激：將大鼠置于空間局限的小鐵籠中，限制其活動及飲食5 h；(2)冷水浸泡應(yīng)激：將大鼠置于空間局限的小鐵籠中，并用冷水浸至大鼠鎖骨以上位置，浸泡2 h；(3)貓驚嚇應(yīng)激：選擇發(fā)情期雌貓，叫聲刺耳，躁急，好動；將鼠籠置入貓籠中12 h，期間大鼠處于恐懼應(yīng)激狀態(tài)。實驗開始后，每天隨機選擇此3種應(yīng)激方案中的1種加于應(yīng)激組大鼠。

2.5觀察指標(biāo)及檢測方法 (1)牙周附著喪失的測量：采用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，待其進入麻醉狀態(tài)后，取仰臥位，固定頭部及四肢，選用自制牙周探針探測牙周附著喪失數(shù)值，牙周探針的刻度單位與工作端直徑均為0.2 mm。牙周附著喪失為釉牙骨質(zhì)界到牙周袋底的距離，測量部位為實驗牙頰、腭側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中共6個點，取平均值。(2)大體標(biāo)本及組織學(xué)觀察：采用頸椎脫臼法處死大鼠，取上頜骨標(biāo)本于10%中性甲醛液中固定48 h以上，修整標(biāo)本，僅保留磨牙區(qū)段牙齒及牙周組織。采用混合脫鈣液脫鈣，制成頰舌向5 μm厚度的牙體牙周組織聯(lián)合切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察牙周組織的組織學(xué)改變。(3) HIF-1α免疫組織化學(xué)SABC法染色及結(jié)果處理：Ⅰ抗HIF-1α稀釋濃度為1∶50，DAB顯色液顯色。陰性對照采用PBS緩沖液代替Ⅰ抗，蘇木素輕度復(fù)染。免疫組化陽性信號為棕黃色細(xì)小顆粒，定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿。對每個標(biāo)本切片中陽性細(xì)胞進行記數(shù)。每個切片記數(shù)5個200倍視野下總細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞率(%)，即陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，取其平均值，為該標(biāo)本切片的平均陽性細(xì)胞率。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1牙周附著喪失(attachmentloss，AL)

各實驗組和正常對照組大鼠牙周AL見表1。(1)牙周炎組和牙周炎+應(yīng)激組AL在各個時點明顯高于正常對照組和單純應(yīng)激組(P<0.01)；(2)單純應(yīng)激組AL在各時點與正常對照組比較均無顯著差異(P>0.05)；(3)牙周炎+應(yīng)激組AL在4、6和8周時明顯高于牙周炎組(P<0.01)。

表1 各實驗組和對照組大鼠牙周附著喪失的變化

2大體標(biāo)本及組織學(xué)改變

正常對照組及單純應(yīng)激組牙齦完整，牙周附著位置正常,見圖1A、C。實驗性牙周炎組第4 周時可見輕度牙齦萎縮，探及淺牙周袋，尚無明顯附著喪失；第6周時出現(xiàn)牙齦萎縮，附著喪失明顯，見圖1B；第8周時牙齦萎縮，附著喪失明顯加重。牙周炎+應(yīng)激組第4 周時大體標(biāo)本出現(xiàn)輕度牙齦萎縮，探及牙周袋，有附著喪失；第6周時牙齦萎縮，附著喪失嚴(yán)重，見圖1D；第8周時牙齦萎縮，附著喪失明顯加重，根分叉暴露，累及兩側(cè)鄰牙。

Figure 1. Samples 6 weeks after ligature.A: normal control group; B: experimental periodontitis group，moderate periodontal pocket was shown; C: stress group, normal sign of periodontium was shown; D: periodontitis with stress group, severe periodontal pocket was shown.

3HIF-1α免疫組化染色結(jié)果

HIF-1α免疫組化陽性信號為棕黃色細(xì)小顆粒，位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)。正常對照組牙周組織未見陽性細(xì)胞，見圖2A；牙周炎組，牙周組織見較多的HIF-1α陽性細(xì)胞，見圖2B；單純應(yīng)激組，牙周結(jié)締組織中見少量弱陽性細(xì)胞，上皮細(xì)胞未見陽性細(xì)胞，見圖2C；牙周炎+應(yīng)激組牙周組織見大量HIF-1α陽性細(xì)胞，見圖2D，且牙周炎+應(yīng)激組HIF-1α陽性表達(dá)明顯多于牙周炎組。

各實驗組平均陽性細(xì)胞率見表2，結(jié)果表明：(1)正常對照組平均陽性細(xì)胞率在各時點與單純應(yīng)激組比較均無顯著差異(P>0.05)；(2)牙周炎組和牙周炎+應(yīng)激組平均陽性細(xì)胞率在各個時點明顯高于正常對照組和單純應(yīng)激組(P<0.01)；(3)與牙周炎組比較，除了在1周時牙周炎+應(yīng)激組平均陽性細(xì)胞率與牙周炎組間無明顯差異(P>0.05)，其余各個時點牙周炎+應(yīng)激組平均陽性細(xì)胞率明顯高于牙周炎組(P<0.01)；(5)牙周炎組和牙周炎+應(yīng)激組在6和8周時平均陽性細(xì)胞率明顯高于1和4周(P<0.01)。

討 論

1心理應(yīng)激是牙周炎的重要危險因子

牙周炎發(fā)病機制復(fù)雜，牙周微生物是牙周病必需的始動因素，但單純的細(xì)菌因素不足以解釋疾病的復(fù)雜性和嚴(yán)重性。研究表明宿主反應(yīng)在牙周病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。心理應(yīng)激是機體對精神壓力或刺激的心理和生理的反應(yīng)。研究顯示心理應(yīng)激和急性壞死潰瘍性牙齦炎有關(guān)。大量的人群調(diào)查顯示牙周炎與心理應(yīng)激有明顯的相關(guān)性[5]。近期的研究認(rèn)為心理應(yīng)激與牙周健康狀況密切相關(guān)，是牙周炎的重要危險因子之一[6，7]。

表2 各實驗組和對照組HIF-1α表達(dá)的平均陽性細(xì)胞率

心理應(yīng)激影響牙周病的機制至今仍未闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為各種社會、心理因素以應(yīng)激為中介，通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)之間的相互作用、相互影響，導(dǎo)致免疫功能低下和內(nèi)分泌失衡，誘發(fā)疾病，如心理應(yīng)激可增加糖皮質(zhì)激素的釋放，抑制炎癥及免疫反應(yīng)，從而降低宿主防御系統(tǒng)的功能。

在本實驗中，我們對大鼠采用限制性應(yīng)激刺激、冷水浸泡應(yīng)激刺激和貓驚嚇應(yīng)激刺激3種應(yīng)激刺激方案，每天隨機選擇其中1種方案對實驗動物進行刺激，以模擬現(xiàn)實社會中應(yīng)激源的多樣性、不確定性，防止了實驗動物對應(yīng)激源的適應(yīng)。在我們的動物實驗中觀察到牙周炎+應(yīng)激組牙周附著喪失明顯高于牙周炎組，組織學(xué)也觀察到牙周炎+應(yīng)激組牙周組織的炎癥程度較牙周炎組更嚴(yán)重。我們的實驗結(jié)果表明單純的應(yīng)激刺激對大鼠正常牙周組織沒有明顯影響，但心理應(yīng)激可以加重牙周炎模型的炎癥程度。Takada等[8]的實驗結(jié)果表明限制性應(yīng)激可加重大鼠牙周炎模型的炎癥進程。Peruzzo等[9]的研究結(jié)果表明慢性心理應(yīng)激通過使局部前炎癥因子和前骨吸收因子的增加，明顯加重了結(jié)扎誘導(dǎo)牙周炎的骨吸收。李博等[10]的研究結(jié)果顯示應(yīng)激可加重牙周組織炎癥的破壞程度，是牙周炎的重要危險因素。

2心理應(yīng)激可能通過降低牙周組織氧代謝加重牙周炎

心理應(yīng)激是牙周炎的重要危險因子之一，有關(guān)心理應(yīng)激影響牙周組織氧代謝的機制國內(nèi)外的研究較少涉及。氧對于細(xì)胞代謝活動及生存是必需的，在缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞許多基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)發(fā)生變化，對缺氧作出應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致代謝紊亂、功能失調(diào)和出現(xiàn)各種各樣的病理生理變化。組織的氧代謝情況可以通過檢測HIF-1α蛋白表達(dá)情況來反映。HIF-1是由α、β 2個亞基組成的堿性螺旋環(huán)螺旋超家族成員，其中HIF-1β能較容易地在所有細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而HIF-1α在正常氧態(tài)下不易檢測到，是細(xì)胞低氧適應(yīng)與應(yīng)答調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，低氧可通過抑制酶對HIF-1α的快速泛素化和降解來提高HIF-1α蛋白的水平。炎癥組織局部的缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)HIF-1α蛋白含量迅速上升，使其表達(dá)增強。通過檢測HIF-1α蛋白在組織局部的表達(dá)情況可反映組織的氧代謝情況。

在我們的實驗中，通過檢測各實驗組在各時點牙周組織內(nèi)HIF-1α蛋白陽性表達(dá)情況來判斷組織內(nèi)的氧代謝情況，并通過計算HIF-1α平均陽性細(xì)胞率來評估組織的缺氧程度。結(jié)果表明牙周組織在炎癥狀態(tài)下，氧代謝降低，單純的應(yīng)激刺激本身不會明顯影響正常牙周組織氧代謝，但應(yīng)激刺激可以明顯降低已經(jīng)存在炎癥的牙周組織的氧代謝，使牙周組織低氧狀況加重，從而加重牙周炎。Manhold等[11]的研究結(jié)果也表明長期或持續(xù)的情緒化狀態(tài)，可以刺激植物神經(jīng)系統(tǒng)，使牙周組織毛細(xì)血管長時間處于收縮狀態(tài)，影響牙齦微循環(huán)，導(dǎo)致氧和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)量減少；他們還發(fā)現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)下的大鼠牙周組織利用氧的能力也會降低。

另外，作為檢測組織是否缺氧的指標(biāo)，HIF-1α不僅與缺氧有關(guān)，其本身也是重要的炎癥因子，低氧狀態(tài)下HIF-1α釋放增多也可能對炎癥產(chǎn)生作用。Cramer等[12]證實在髓樣細(xì)胞HIF-1基因缺陷的炎癥模型中，與HIF-1基因無缺陷的炎癥模型相比，炎癥滲出基本消失，提示HIF-1α具有調(diào)節(jié)炎癥區(qū)微環(huán)境的的作用。Hellwig-Bürgel等[13]的研究表明HIF-1α可能參與調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中涉及的基因表達(dá)。Albina等[14]證實HIF-1α等能以非低氧誘導(dǎo)的形式誘導(dǎo)傷口愈合初期炎癥細(xì)胞HIF-1α產(chǎn)生。夏紅利等[15]的研究顯示HIF-1α在急性胰腺炎的發(fā)病機制中起促進炎癥發(fā)展的作用。劉金波等[16]的研究表明在牙髓炎發(fā)生時，缺血、缺氧環(huán)境誘導(dǎo)HIF-1α的產(chǎn)生，炎癥因子如IL-1和TNF-α等可激活 HIF-1α，從而使得 HIF-1α在上游水平調(diào)控iNOS、VEGF啟動修復(fù)機制成為可能，據(jù)此推測 HIF-1α作為一個調(diào)控因素，對炎癥的進程起調(diào)節(jié)作用。An等[17]的研究還表明HIF-1α與缺氧環(huán)境中細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，HIF-1α表達(dá)增強除了表明組織氧代謝降低外，HIF-1α還可能參與炎癥進程的調(diào)節(jié)，與炎癥發(fā)展有著多方面的聯(lián)系。

我們的結(jié)果表明心理應(yīng)激可能通過降低牙周組織局部的氧代謝水平，使局部組織處于缺氧狀態(tài)，起到加重牙周炎癥的作用。低氧狀態(tài)下，HIF-1α的釋放增多可能還直接參與調(diào)節(jié)牙周病的炎癥進程。在牙周炎的治療方案中，可以考慮通過糾正牙周局部低氧狀態(tài)，提高牙周局部供氧量，緩解組織缺氧，減少牙周組織的破壞，為處于應(yīng)激狀態(tài)下的牙周炎患者提供更加合理有效的治療方案。在制定牙周炎治療計劃時應(yīng)對患者的心理狀態(tài)予以評估和重視，以期制定更個體化、更高效的治療方案。

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Effectofpsychologicalstressondevelopmentofperiodontitisandexpressionofperiodontalhypoxia-induciblefactor1αinrats

ZHANG Zeng-fang1,3, Lü Fang-li2, CHEN Ying2, YANG Xiao-yan2, HUANG Qi-ling1, LI Dong-jian4, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,KeyLaboratoryofTropicalDiseaseControl(SunYat-senUniversity),MinistryofEducation,Guangzhou510080,China;3DepartmentofStomatology,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,Guangzhou510120,China;4StomatologicalHospitalofLiwanDistrict,Guangzhou510170,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of psychological stress on the development of periodontitis and the expression of periodontal hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α) in rats.METHODSForty-eight male Wistar rats(SPF grade) were randomly divided into 4 groups:(1) normal control group, i.e. naive rats;(2) experimental periodontitis group: the periodontitis model was induced by wrapping 3-0 silk ligature inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left maxillary second molar of the rats;(3) stress group: the rats were treated with stress alone;(4) periodontits with stress group, the periodontitis model was induced as above,and the rats were treated with stress. The rats were sacrificed at week 1, 4, 6 and 8 after the ligature. The attachment losses(AL) were measured by home-made probe. The histological changes of periodontal tissues stained with hematoxylin and eosin(HE) were observed under microscope. The HIF-1α expression level in the periodontal epithelium was determined by immunohistochemistry that was used to evaluate the severity of hypoxia by measuring the average rate of HIF-1α-positive cells.RESULTSNo significant difference of AL between stress group and normal control group was observed(P>0.05).The AL and the average rate of HIF-1α-positive cells in periodontitis with stress group were significantly higher than those in experimental periodontitis group at time points of week 4,6 and 8 after ligature(bothP<0.01).CONCLUSIONPsychological stress is one of the periodontitis inducing factors in the animal model. Psychological stress may aggravate periodontitis by decreasing tissue oxygenation in rats.

Periodontitis; Models,animal; Psychological stress; Hypoxia-inducible factor 1α

R78

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-020

1000-4718(2011)02-0315-05

2010-09-26

2010-10-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81071387);廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.10151008901000006)△通訊作者 Tel:020-85221165; E-mail: thshg@126.com