脂肪分化相關(guān)蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對H9c2心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

鮑苑苑, 方 舟, 周麗諾△, 胡仁明, 丁 薇

(復(fù)旦大學(xué)1附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科，2生命科學(xué)院，上海 200040)

脂肪分化相關(guān)蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對H9c2心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

鮑苑苑1, 方 舟2, 周麗諾1△, 胡仁明1, 丁 薇1

(復(fù)旦大學(xué)1附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科，2生命科學(xué)院，上海 200040)

目的構(gòu)建編碼脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein, ADRP)基因全長序列的真核表達(dá)載體，探討ADRP過表達(dá)對軟脂酸誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡有何影響。方法(1)RT-PCR擴增編碼ADRP全長的 DNA 序列，重組入pEGFP-C1質(zhì)粒表達(dá)載體中，酶切、測序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取陽性克隆，擴增后提取質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將鑒定后的重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞；熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況；RT-qPCR和Western blotting檢測ADRP表達(dá)情況；(2)采用MTT比色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度軟脂酸對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果(1)成功構(gòu)建了真核質(zhì)粒表達(dá)載體pEGFP-C1-ADRP，轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)；RT-qPCR和Western blotting顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞ADRP mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和正常對照組(P<0.01)；(2)經(jīng)不同軟脂酸刺激后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和正常對照組(P<0.05)。結(jié)論(1)成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)ADRP的H9c2心肌細(xì)胞株；(2)軟脂酸可抑制H9c2心肌細(xì)胞增殖并可誘導(dǎo)其凋亡，而ADRP高表達(dá)可對抗軟脂酸的這一作用，表明ADRP對高脂環(huán)境中心肌細(xì)胞可能具有一定的保護(hù)作用。

脂肪分化相關(guān)蛋白質(zhì)； H9c2細(xì)胞； 棕櫚酸； 細(xì)胞凋亡

糖尿病心臟病是糖尿病患者死亡的最主要原因之一，其早期的臨床表現(xiàn)為心室舒張功能障礙，隨后可出現(xiàn)收縮功能受損，逐漸發(fā)展為充血性心力衰竭。糖尿病心臟病患者存在游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)過剩，可對心肌細(xì)胞造成損傷[1]。脂肪分化相關(guān)蛋白(adipocyte differentiation-related protein，ADRP)是細(xì)胞內(nèi)脂滴表面PAT家族蛋白的一種。研究發(fā)現(xiàn)，ADRP可促進(jìn)細(xì)胞對FFA的吸收并將其轉(zhuǎn)化為甘油三酯(triglyceride, TG)儲存于脂滴內(nèi)[2]。目前ADRP與糖尿病的關(guān)系尚存在爭議，Minnaard等[3]認(rèn)為糖尿病者ADRP水平升高可使細(xì)胞內(nèi)FFA水平升高，對細(xì)胞造成一定的損傷；而Phillips等[4]則認(rèn)為ADRP水平升高可使細(xì)胞內(nèi)FFA轉(zhuǎn)化為TG從而避免損傷細(xì)胞。此外，ADRP在心肌病方面的研究報道少見。鑒于此，本研究構(gòu)建ADRP高表達(dá)H9c2心肌細(xì)胞穩(wěn)定株，并用軟脂酸(palmitic acid，PA)刺激，觀察ADRP高表達(dá)后對PA刺激心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，可能為糖尿病心臟病的基因治療提供新的作用靶點。

材 料 和 方 法

1材料

1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株 原核質(zhì)粒表達(dá)載體pEGFP-C1、大腸埃希菌株DH5α均由上海華山醫(yī)院中心實驗室提供，H9c2心肌細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑 編碼ADRP全長的DNA序列引物由上海生工生物工程公司合成；限制性內(nèi)切酶BclⅡ和HindⅢ、T4 DNA連接酶及預(yù)染蛋白質(zhì)分子量marker購于Fermentas；Trizol購于Invitrogen；SYBR green real-time PCR master mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Toyobo；高純度質(zhì)粒小提中量提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、DL2000及D15000核酸電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)、LipofectamineTM2000(Lipo 2000)購于Tiangen；PA、Opti-MEM購于Gibco；兔源性抗ADRP多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP購于Sigma；Annexin Ⅴ-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于BD；噻唑藍(lán)溴鹽(MTT)購于Ameresco。

2方法

2.1pEGFP-C1-ADRP 質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建 采用主動脈逆行插管的方法[5]，收集大鼠心肌細(xì)胞，按照試劑盒步驟抽提總RNA并逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說明擴增全長ADRP基因序列。擴增ADRP的引物為：上游5 ’-ccc aagctt gtt agg cgt ctc ttt tct cca-3’(下劃線為HindⅢ酶切位點)，下游5’-tgc ccgcgg ctg gtg aca agg agg ggt tta-3’(下劃線為SacⅡ酶切位點)。反應(yīng)體系為30 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 3.5 min,擴增35個循環(huán)。對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，并進(jìn)行切膠回收純化、測序鑒定。用限制性內(nèi)切酶BclⅡ和HindⅢ對擴增產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收并純化后，用T4 DNA連接酶將擴增產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α大腸埃希菌，隨機挑取陽性克隆，擴增后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序鑒定。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 選取對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.25% Trypsin消化，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞制成密度為1×109cells/L的單細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞長至約80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipo2000試劑盒說明操作，將pEGFP-C1-ADRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)，并將空質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞作為陰性對照，正常H9c2心肌細(xì)胞作為空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后改用含G-418(500 mg/L)的選擇培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3周，正常H9c2細(xì)胞全部死亡，挑取具有抗性的單克隆擴增進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3重組質(zhì)粒在H9c2心肌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的鑒定

① 熒光顯微鏡間接觀察ADRP基因表達(dá) 經(jīng)3周培養(yǎng)后，于倒置熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒報告基因GFP的表達(dá)，間接監(jiān)測目的基因ADRP表達(dá)情況，并對熒光顯微鏡下2種細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀察。

② 反轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)檢測ADRP基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行擴增。引物為：上游5’-aag agg cca aac aaa aga gcc agg aga cca-3’，下游5’-acc ctg aat ttt ctg gtt ggc act gtg cat-3 ’。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為： 95 ℃ 15 s,63 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,擴增40個循環(huán)，采用GAPDH基因作為內(nèi)參照。

③ Western blotting檢測ADRP蛋白的表達(dá) 超聲法提取上述3種細(xì)胞總蛋白，BCA法測定其蛋白濃度，然后行SDS-10%PAGE電泳分離。電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜，然后用麗春紅染色觀察蛋白轉(zhuǎn)移情況，轉(zhuǎn)移液脫色后浸入5%脫脂牛奶溶液中室溫封閉2 h，PBST洗滌后加入兔源性抗ADRP抗體(1∶1 000)，室溫孵育3 h或4 ℃過夜，PBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫孵育1 h，PBST洗滌后用化學(xué)發(fā)光法顯色。采用GAPDH作為內(nèi)參照。

2.4PA干預(yù) 分別用含1%BSA的DMEM高糖培養(yǎng)基和含有1%BSA及不同濃度PA的DMEM高糖培養(yǎng)基(按照Cousin等[6]文獻(xiàn)報道的方法配置PA/BSA混和溶液，經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜過濾后經(jīng)DMEM溶液倍比稀釋，得到PA濃度為0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L DMEM溶液)培養(yǎng)3種細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.5MTT比色法檢測心肌細(xì)胞增殖活力 選取對數(shù)生長期的3種細(xì)胞，以0.25%trypsin消化，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞分散成密度為5×107cells/L的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL。培養(yǎng)24 h后換含有PA(終濃度分別為0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每種濃度組及對照組均做6個平行孔。分別處理24 h、48 h和72 h后，每孔加入新鮮配置的MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h。待測定時小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振蕩混合器上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，然后測定570 nm波長處各孔吸光度(A)值。抑制率按照以下公式計算：抑制率=(1-PA干預(yù)組平均A值/對照組平均A值)×100%。實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 待測細(xì)胞用不含EDTA的trypsin消化收集，加入1 mL預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次后，將細(xì)胞重懸于500 μL binding buffer中，使其每孔濃度為109cells/L，加入5 μL Annexin V-PE混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，2 000 rpm/min離心10 min，棄去上清加入500 μL binding buffer和5 μL的7-AAD混勻避光反應(yīng)10 min后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)進(jìn)行3次。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1重組質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示，PCR擴增產(chǎn)物ADRP約1.2 kb,見圖1，測序鑒定結(jié)果與GenBank報道的完全一致(ADRP登錄號為BC085861，測序圖譜略)，無PCR引起的突變。用限制性內(nèi)切酶SacⅡ和HindⅢ對重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ADRP進(jìn)行雙酶切后，電泳分析，可見除了有4 700 bp的質(zhì)粒載體譜帶外，還有相應(yīng)目的基因片段大小的譜帶,見圖2。對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果與GenBank報道的完全一致(ADRP登錄號為BC085861，測序圖譜略)。

Figure 1. Electrophoresis analysis(2% agarose gel) of ADRP PCR products. Lane 1-4：ADRP; Lane 5: DL2000 DNA marker.

Figure 2. Identification of recombination vector by enzyme digestion. Lane 1:DL15000 DNA marker; Lane 2-4: digestive productsof pEGFP-C1-ADRP(4.7 kb and 1.7 kb); Lane 5: digestive product of pEGFP-C1; Lane 6: pEGFP-C1; Lane 7: DL2000 DNA marker.

2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞株的建立

2.1熒光顯微鏡觀察 倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均有綠色熒光穩(wěn)定表達(dá)，傳代20次以上仍無消失。

2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞ADRP mRNA的表達(dá)水平 從3種細(xì)胞中提取的總RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外透射分析儀下觀察，顯示清晰的28S、18S 2條條帶，且28S∶18S約為2∶1，提示RNA提取完整、無降解；進(jìn)一步檢測所有總RNA樣品的A260 nm/A280 nm值均大于1.8，表明總RNA純度較高，能滿足逆轉(zhuǎn)錄需求。熒光定量PCR結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ADRP mRNA的表達(dá)水平明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和正常H9c2細(xì)胞組細(xì)胞(P<0.01)，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ADRP mRNA的表達(dá)水平與正常H9c2細(xì)胞組相比無顯著差異(P>0.05)。

Figure 3. Expression level of ADRP mRNA by RT-qPCR in H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP or pEGFP-C1 and normal H9c2 cells. pEGFP-C1: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1; pEGFP-C1-ADRP: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP.±s.n=3.**P<0.01 vs H9c2 cells transfected with pEGFP-C1 or normal H9c2 cells.

2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞ADRP蛋白的表達(dá)水平 Western blotting結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ADRP的表達(dá)水平明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和正常H9c2細(xì)胞組細(xì)胞(P<0.01)，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ADRP的表達(dá)水平與正常H9c2細(xì)胞組相比無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Expression level of ADRP protein by Western blotting in H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP or pEGFP-C1 and normal H9c2 cells. Lane 1: normal H9c2 cells; Lane 2: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP; Lane 3: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1.

3PA對重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞增殖的影響

如表1所示，不同濃度的PA對3種細(xì)胞生長均有一定的抑制作用，隨著PA濃度增大、作用時間延長，其對3種細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(P<0.05)，并且PA對3種細(xì)胞增殖的抑制作用均呈明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。

表1 PA對正常H9c2細(xì)胞、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖的影響

在同一PA處理濃度和相同處理時間下，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制率明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞(P<0.05)，正常H9c2細(xì)胞與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比抑制率無明顯差異(P>0.05)。

4PA對重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，PA處理3種細(xì)胞72 h后，與對照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，并呈明顯的劑量效應(yīng)依賴關(guān)系；同一PA濃度刺激時，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率與正常H9c2細(xì)胞相比無明顯差異(P>0.05)，而重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞(P<0.05)，表明ADRP基因可能對PA刺激引起的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，見圖5。

Figure 5. Effect of PA at different doses on cell apoptosis of H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP or pEGFP-C1 and normal H9c2 cells(72 h later). ±s.n=3.*P<0.05,** P<0.01 vs H9c2 cells or H9c2 cells transfected with pEGFP-C1

討 論

脂肪酸是心臟能量產(chǎn)生的主要來源，在多種疾病狀態(tài)下，心肌細(xì)胞脂肪酸代謝異?？梢鸺?xì)胞內(nèi)FFA增高和脂代謝中間產(chǎn)物積聚，進(jìn)而導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能受損。動物實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病動物模型心肌細(xì)胞中FFA水平的升高可導(dǎo)致細(xì)胞胰島素抵抗的發(fā)生及細(xì)胞凋亡率的增加，從而加快了糖尿病心衰或心肌病的進(jìn)程。近來研究發(fā)現(xiàn)，ADRP可通過促進(jìn)高脂環(huán)境培養(yǎng)下骨骼肌細(xì)胞對FFA的吸收和轉(zhuǎn)化來降低細(xì)胞內(nèi)FFA水平，從而避免FFA對骨骼肌細(xì)胞的損傷[3，4]，然而有關(guān)ADRP對高脂環(huán)境下心肌細(xì)胞的影響尚未見文獻(xiàn)報道。

H9c2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎心臟組織，具有增殖能力強、易培養(yǎng)等特點，目前廣泛用于細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖及凋亡等的研究[7]?；蜣D(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的方式主要有4種：電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法和磷酸鈣法實驗條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法前期準(zhǔn)備較復(fù)雜，費用較高，且可能對細(xì)胞有較大影響；而脂質(zhì)體介導(dǎo)法與上述幾種方法相比，操作簡單，適用范圍廣，轉(zhuǎn)染效率較高，細(xì)胞毒性較低。本研究構(gòu)建了含有EGFP報告基因的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ADRP，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)入H9c2細(xì)胞中。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染的正常H9c2細(xì)胞則未見熒光；RT-qPCR與Western blotting結(jié)果顯示，與正常H9c2細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞ADRP mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，這表明高表達(dá)ADRP心肌細(xì)胞穩(wěn)定株構(gòu)建成功。

本實驗采用MTT法觀察了PA對重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和正常H9c2細(xì)胞組細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，PA對3種細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用，并呈明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系；相同PA處理條件(相同濃度和作用時間)下，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞抑制率明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞(P<0.05)，表明ADRP基因高表達(dá)可對抗PA對H9c2心肌細(xì)胞增殖的抑制作用，即ADRP可能具有保護(hù)心肌細(xì)胞免于高脂環(huán)境損傷的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，高脂環(huán)境(PA)可誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[8]。那么PA對心肌細(xì)胞有何影響？將ADRP轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可否對抗PA引起的細(xì)胞凋亡？基于此，我們采用不同濃度的PA刺激重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)PA刺激后各組細(xì)胞凋亡率均有所增加，且具有明顯的劑量效應(yīng)依賴性，推測其原因可能是PA使心肌細(xì)胞中長鏈酯酰輔酶A增多，非氧化代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺濃度升高，通過NF-κB介導(dǎo)，釋放細(xì)胞色素C，引起細(xì)胞凋亡[9]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相同PA濃度作用下，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和正常H9c2細(xì)胞組(P<0.05)，表明ADRP高表達(dá)也可通過抑制高脂環(huán)境誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡來保護(hù)心肌細(xì)胞，推測原因可能是由于ADRP高表達(dá)使PA以TG的形式儲存在脂滴內(nèi)，避免了PA對心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷。

綜上，我們成功建立了穩(wěn)定表達(dá)ADRP的H9c2心肌細(xì)胞株，觀察到相同PA作用條件下重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖和凋亡率均明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和正常H9c2細(xì)胞組細(xì)胞，表明ADRP可能對細(xì)胞內(nèi)FFA升高造成的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。目前ADRP影響心肌細(xì)胞脂肪代謝途徑的研究較少，因此有關(guān)ADRP對高脂環(huán)境中心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機制尚不清楚，有待于我們進(jìn)一步研究。

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Effectofadiposedifferentiation-relatedproteinonproliferationandapoptosisinH9c2cells

BAO Yuan-yuan1, FANG Zhou2, ZHOU Li-nuo1, HU Ren-ming1, DING Wei1

(1DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,HuashanHospital,2AcademyforLifeScience,FudanUniversity,Shanghai200040,China.E-mail:zhoulinuo@yahoo.cn)

AIM: To construct an adipose differentiation-related protein(ADRP) eukaryotic expression vector and to explore the effect of ADRP on apoptosis of H9c2 cells induced by palmitic acid(PA).METHODSThe ADRP gene obtained by the method of RT-PCR was cloned into pEGFP-C1 plasmid. The recombinant plasmid was transformed intoE.coliDH5α for amplification. The recombinant plasmid was extracted fromE.coliDH5α and transfected into H9c2 cells by LipofectamineTM2000. The stable transformants were selected by G418 screening. Expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope and the ADRP expression was identified by RT-qPCR and Western blotting analysis. The effect of PA on the proliferation of H9c2 cells was detected by MTT assay. The apoptotic percentage of H9c2 cells caused by PA was determined by flow cytometry.RESULTSThe eukaryotic expression vector pEGFP-C1-ADRP was successfully constructed. Green fluorescent was observed in the cells transfected with pEGFP-C1 or pEGFP-C1-ADRP under fluorescence microscope. RT-qPCR and Western blotting analysis showed that recombinant cells exhibited high mRNA and protein levels of ADRP. After treated with PA at different concentrations, the apoptosis rates and the proliferation inhibition of recombinant cells were both lower than those of the other two cells.CONCLUSIONThe transfected H9c2 cells with stable ADRP expression were successfully established. The over-expression of ADRP prevents the cells from apoptosis and inhibition of proliferation caused by PA, indicating that ADRP plays a protective role in H9c2 cells.

Adipose differentiation-related protein; H9c2 cells; Palmitic acid; Apoptosis

R589.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-003

1000-4718(2011)02-0223-06

2010-10-08

2010-11-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30270627)

△ 通訊作者Tel：021-52888143；E-mail：zhoulinuo@yahoo.cn

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