木瓜蛋白酶制備大豆抗癌活性肽的研究

吳 非 于勝男 葛錫娟 王 鵬 李 良

(東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030)

木瓜蛋白酶制備大豆抗癌活性肽的研究

吳 非 于勝男 葛錫娟 王 鵬 李 良

(東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030)

以大豆分離蛋白為原料，以細胞生長抑制率為指標，用木瓜蛋白酶對其進行酶解，得到大豆抗癌活性肽。木瓜蛋白酶的最佳作用條件為:溫度55℃、酶添加量7 000 U/g、反應pH 7.5、底物質量分數(shù)6%、酶解時間4 h。在抗癌活性肽制備過程中，對水解度和肽活性之間的關系進行了研究。結果表明，水解度與大豆肽的抗癌活性不呈線性關系。用10 000 u和5 000 u的超濾膜處理木瓜蛋白酶的酶解產物，在不同分子質量的超濾組分中，分子質量小于5 000 u組分的癌細胞生長抑制率最高，達32.58%。

大豆抗癌活性肽 制備 木瓜蛋白酶

大豆含有35%～40%的蛋白質，是食物蛋白的一種重要來源［1］。大豆肽是大豆蛋白經蛋白酶作用后，再經過特殊處理所得到的蛋白質分解物。國內對大豆多肽的研究主要集中在抗氧化性、抗高血壓性、降血脂和降膽固醇方面［2－5］，有關大豆抗癌活性肽的報道較少。前期研究結果表明，大豆多肽也具有抗癌活性［6］。

癌癥是當今發(fā)病率最高的疾病，嚴重危害人類健康。目前我國癌癥患者已超過750萬，每年約有130多萬人死于癌癥，而且其發(fā)病率和死亡率還在逐年遞增［7］。合成的抗癌藥物雖能有效地控制疾病，但同時它也具有造成免疫系統(tǒng)損傷、骨髓受抑制等副作用［8］，因而，研究食品源的抗癌活性肽具有十分重要的意義。我國是大豆的主產國，大豆資源非常豐富［9］，為研究大豆抗癌活性肽提供了物質基礎。前期研究結果表明，多種蛋白酶都可以用來制備大豆抗癌活性肽，木瓜蛋白酶的制備效果更加突出［6］。大豆抗癌活性肽具有安全性高、毒副作用小、容易吸收和易于制備等優(yōu)點［10］。該論文研究結果對開發(fā)大豆抗癌活性肽產品、預防和輔助治療疾病、促進大豆精深加工都具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料及設備

大豆分離蛋白:國家大豆工程技術研究中心。胃癌細胞7901:乳品國家重點實驗室;木瓜蛋白酶:無錫杰能科生物有限公司;其他試劑均為分析純。

快速離心機:北京醫(yī)用離心機廠;凱氏定氮儀:上海新嘉電子有限公司;冷凍干燥機:上海醫(yī)用離心機廠;Labscale TFF System超濾系統(tǒng):Millipore;超凈工作臺:北京安泰;CO2細胞培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS;酶聯(lián)免疫檢測儀:美國BIO－RAD。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料常規(guī)指標測定

蛋白質含量的測定方法按照 GB/T 5009.5—2003，水分含量的測定方法按照 GB/T 5009.3—2003，灰分的測定方法按照GB/T 5009.4—2003。

1.2.2 酶活力測定

采用福林－酚法進行測定，參照SB/T 10317—1999。

1.2.3 水解度(DH)測定

依據(jù)pH－Stat法，蛋白質水解時會釋放出氨基酸使溶液的pH變化，通過滴定保持蛋白酶的最佳反應pH環(huán)境，因此，水解度可由水解過程中NaOH的消耗量來計算［11］。

式中:VNaOH為水解過程中消耗NaOH的量/mL，Mp為底物蛋白質的總量/g，NNaOH為NaOH的當量濃度/mol/L，Htot為每克蛋白質中肽鍵的克當量數(shù)(取7.8)，α 為氨基的解離度，1/α =1+10(pK－pH)

1.2.4 大豆肽抗癌活性的測定

采用MTT法測定大豆肽對胃癌細胞的生長抑制率［12］。

1.2.5 大豆抗癌活性肽的制備研究

配制質量分數(shù)為6%的大豆分離蛋白溶液，在90℃熱處理15 min，然后，將反應條件調至木瓜蛋白酶反應的最適條件［13］，用6 000 U/g酶活單位的木瓜蛋白酶進行水解制備大豆肽。反應過程中用1 mol/L的NaOH溶液或HCl調節(jié)酸堿度，使其一直處于酶的最適反應pH值，并使溫度始終保持在酶反應的最適溫度。在酶解開始后2、3、4、5、6 h取水解液，在100℃條件下保溫15 min使酶失活，調節(jié)pH到大豆分離蛋白等電點pI 4.5后，4 000 r/min離心15 min，取上清液測水解度。余下上清液進行凍干，取一定質量的凍干粉溶于磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，溶液過0.2 μm的濾膜后，作用于胃癌細胞，測定細胞生長抑制率。以底物濃度、溫度、pH、酶用量、酶解時間為因素，以癌細胞生長抑制率為檢測指標，采用5因素5水平正交試驗設計(見表1)，確定木瓜蛋白酶的最優(yōu)反應條件。

表1 L25(55)因素水平表

1.2.6 大豆抗癌活性肽的超濾分離

將大豆分離蛋白的酶解液通過截留分子質量為10 000 u和5 000 u的聚醚砜膜，將10 000 u的超濾膜的濾過液作為5 000 u超濾膜的起始液，超濾條件為壓力0.2 Mpa、pH 7.0。分別收集外液和內液，得到分子質量大于10 000 u、分子質量在10 000～5 000 u之間和分子質量小于5 000 u的3種酶解液。凍干后測定其細胞生長抑制率。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)的整理采用Microsoft Excel(Office 2007)軟件完成;試驗數(shù)據(jù)采用SAS8.1軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 大豆分離蛋白的常規(guī)指標

試驗所用大豆分離蛋白含蛋白質、水分、灰分分別為 90.33%、3.72%、3.04%。

2.2 蛋白酶的活力

通過繪制酪氨酸標準曲線得回歸方程為Y=0.010 6x －0.002 5，R2=0.984 6。式中，x 代表酪氨酸質量濃度(g/mL)，Y代表OD值，0.984 6為標準曲線的線性相關系數(shù)。結果表明，木瓜蛋白酶活力為23 106.3 U/g。酶活性的測定對本試驗十分重要，它反應了1 g酶制劑在適宜的條件下水解酪蛋白的能力。

2.3 用木瓜蛋白酶制備大豆抗癌活性肽的酶解條件優(yōu)化

以底物濃度、酶用量、溫度、水解時間、pH為單因素進行試驗，以癌細胞生長抑制率為檢測指標，研究單因素對于木瓜蛋白酶酶解液抗癌活性的影響。單因素試驗確定了底物質量分數(shù)、酶用量、溫度、水解時間、pH 分別為 6%、7 000 U/g、55 ℃、4 h、7.5時，其對癌細胞生長抑制作用效果最佳。

表2 木瓜蛋白酶制備大豆抗癌活性肽的正交試驗結果

經過預試驗(單因素)考慮確定了其試驗因素的范圍，對底物質量分數(shù)、酶用量、酶解溫度、酶解時間和pH值，進行5因素5水平的正交試驗設計，確定木瓜蛋白酶制備大豆抗癌活性肽的最優(yōu)條件，試驗結果見表2。

從表2正交試驗的極差分析可以看出，各因素對木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白的影響次序依次是:底物質量分數(shù)＞酶解溫度＞酶用量＞反應pH＞酶解時間。反應條件最佳組合為A3B4C3D4E4，即木瓜蛋白酶制備大豆抗癌活性肽的最優(yōu)作用條件為:酶解溫度55℃、酶添加量7 000 U/g、反應pH 7.5、酶解時間4 h、底物質量分數(shù)6%。

2.4 大豆抗癌活性肽的細胞生長抑制率與水解度之間的關系

在木瓜蛋白酶的不同酶解時間下，測定水解度和大豆肽的細胞生長抑制率，結果見圖1。

圖1 細胞生長抑制率與水解度之間的關系

由圖1可以看出，細胞生長抑制率與水解度之間并不呈線性關系，當水解度為20.95%時，有最大的細胞生長抑制率28.34%;當水解度繼續(xù)增大時，細胞生長抑制率有所下降，而后趨于平穩(wěn)。原因是隨著酶解反應的進一步發(fā)生，可與酶反應的底物逐漸減少，酶切位點也逐漸減少，同時酶活性也有所降低，產物的積累對酶的作用也會產生競爭性抑制，而且已產生的有活性肽段會被進一步水解，所以，酶解產物的活性有所下降。

2.5 超濾分離大豆抗癌活性肽

將酶解液進行超濾，獲得分子質量大于10 000 u、分子質量在10 000～5 000 u之間和分子質量小于5 000 u的3種大豆肽。測定其細胞生長抑制率，結果見圖2。

比較分子質量大于10 000 u、10 000～5 000 u、小于5 000 u和未超濾的4種組分的癌細胞生長抑制率，結果表明，分子質量小于5 000 u的組分的癌細胞生長抑制率最高，為32.58%。通過差異性分析可知，分子質量小于5 000 u組分的癌細胞生長抑制率與其他組分的癌細胞生長抑制率差異顯著。因此，選擇5 000 u的超濾膜來分離木瓜蛋白酶的酶解產物。

圖2 超濾獲得的不同分子質量大豆肽的細胞生長抑制率比較

3 結論

3.1 以蛋白質90.33%、水分3.72%、灰分3.04%的大豆分離蛋白為底物，用活力為23 106.34 U/g的木瓜蛋白酶水解，制備大豆抗癌活性肽。木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為:溫度55℃、酶添加量7 000 U/g、反應pH 7.5、底物質量分數(shù)6%、酶解時間4 h。

3.2 水解度與大豆肽的抗癌活性不呈線性關系。水解度在4 h內上升，然后趨于穩(wěn)定，而細胞生長抑制率在達到最高值后有下降的趨勢。

3.3 用超濾膜處理木瓜蛋白酶制備的大豆抗癌活性肽，獲得分子質量大于10 000 u、分子質量在10 000～5 000 u之間和分子質量小于5 000 u的3種組分。其中，分子質量小于5 000 u組分的癌細胞生長抑制率最高，達32.58%。

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Research on Preparation of Soybean Anti－cancer Bioactive Peptide by Papain

Wu Fei Yu Shengnan Ge Xijuan Wang Peng Li Liang
(Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030)

In this paper， the soybean protein isolate was used as a raw material and treated by papain to obtain soybean anti－ cancer bioactive peptide，of which cell growth inhibitory value was regarded as an index.The optimal treating conditions of papain were:hydrolysis temperature 55 ℃，protease dosage 7 000 U/g，pH value 7.5，substrate concentration 6%and enzymolysis time 4 h.The relationship between degree of hydrolysis and anti－ cancer activity was studied in the preparation of anti－ cancer peptide.The results showed that cancer cell growth inhibitory value had no linear relationship with the hydrolysis degree.The hydrolysate was separated by the 10 000 u and 5 000 u ultrafiltration membrane.The part of molecular weight less than 5 000 u had the highest anti－cancer activity，up to 32.58%.

soybean anti－ cancer bioactive peptide，preparation，papain

TS214

A

1003－0174(2011)11－0094－04

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才基金(2008RFQXN016)

2010－12－30

吳非，女，1968年出生，教授，博士生導師，大豆產品精深加工