超聲輔助脂肪酶催化合成富含n－3多不飽和脂肪酸磷脂的研究

詹忠根

超聲輔助脂肪酶催化合成富含n－3多不飽和脂肪酸磷脂的研究

詹忠根

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州 310018)

以脂肪酶Lipozyme TL IM為催化劑，研究了合成富含n－3多不飽和脂肪酸磷脂的最佳工藝條件，即以正庚烷∶異辛烷∶正已烷=8∶1∶1為超聲介質(zhì)，溶劑(mL)/底物(g)=2，酶用量為25%，超聲介質(zhì)中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，超聲功率70 W，55℃下連續(xù)超聲5．5 h，在此條件下酯交換到磷脂上的DHA和EPA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22．99%。由此可見(jiàn)，通過(guò)超聲輔助及酯交換條件的優(yōu)化，不僅可以大大縮短反應(yīng)所需的時(shí)間，而且也能充分激活Lipozyme TL IM的酶活力，從而提高酯化反應(yīng)的效率。

超聲輔助 脂肪酶 n－3多不飽和脂肪酸

n－3多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)與二十碳五烯酸(EPA)具有促進(jìn)胎兒發(fā)育、提高兒童智商、預(yù)防心血管疾病、降血脂、延緩衰老、預(yù)防老年性癡呆、防止癌癥等生理功能。而卵磷脂是一種優(yōu)良的乳化劑，可作為血管的清道夫;具有健腦養(yǎng)腦、保護(hù)肝臟;可作為糖尿病、膽結(jié)石患者的營(yíng)養(yǎng)品;能消除青春痘、雀斑、滋養(yǎng)皮膚;預(yù)防老年癡呆等。由于DHA和EPA在磷脂分子中比在三酰甘油分子中更利于人體消化吸收，生理活性更強(qiáng)，且比它作為脂肪酸或其甲、乙酯及甘油酯形式穩(wěn)定性增強(qiáng)，不易被氧化，在食品、化妝品、藥品中有廣泛的用途。此前，潘麗等［1］、金華麗等［2］在正已烷反應(yīng)體系中，以脂肪酶Novozym 435為催化劑，探討了大豆粉末磷脂與DHA、EPA酯交換反應(yīng)的最佳工藝條件。但由于該研究所使用的脂肪酶Novozym 435的價(jià)格偏高、反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等不足，因此急需探尋低成本、高效率的合成體系，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與設(shè)備

大豆卵磷脂:質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，氮化合物(以N計(jì)):0．9 ±0．3，磷化合物(以 P 計(jì)):2．3 ±0．3;Lipozyme TL IM(Thermomyces lanuginosis脂肪酶):丹麥Novo公司;魚(yú)油:無(wú)錫市迅達(dá)海洋生物制品廠，含量DHA 70%、EPA 10%，平均密度0．94 g/mL;其他試劑均為分析純。

7890A GC/MS:美國(guó) Agilent公司;KQ－500DB超聲波發(fā)生器:昆山市超聲儀器有限公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 富含n－3多不飽和脂肪酸DHA/EPA磷脂制備與檢測(cè)

合成:在50 mL的錐形瓶中，加入一定量卵磷脂、魚(yú)油、溶劑、脂肪酶Lipozyme TL IM，放在超聲頻率為40 kHz的超聲發(fā)生器中，在一定功率下定溫反應(yīng)一段時(shí)間后進(jìn)行純化。

純化［1］:待酯化反應(yīng)結(jié)束后低速離心(3 500～4 000 r/min)，回收固定化酶，離心兩次，以便最大限度除去酶。然后混合液在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑。再將此混合物置于100 mL燒杯中，每次加入8～10 mL冷丙酮(0℃)洗滌，用自動(dòng)攪拌儀攪拌10 min后進(jìn)行離心(3 500～4 000 r/min)，以洗脫游離的脂肪酸，直至取少量上清液于潔凈的玻璃片上，快速揮干后無(wú)油漬為止，所得固形物經(jīng)真空干燥(50℃)后即得粉末結(jié)構(gòu)化磷脂，并保存于－20℃。

甲酯化［3］:稱取結(jié)構(gòu)化磷脂50 mg加1%硫酸－甲醇2 mL于70℃水浴加熱30 min，加入正已烷2 mL，再加蒸餾水至瓶頸，取出上清液，再用1 mL正已烷洗1次，合并上清液(注意要加NaOH中和到pH=7)，放入小瓶中待測(cè)。

氣相色譜檢測(cè)條件:溫箱溫度140℃，保持2 min，然后按6℃/min升溫至170℃，保持1 min，再以3．5 ℃/min升溫至240 ℃，保持12．5 min，最后以12℃/min升溫至260℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度250℃，載氣氦氣流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣。檢測(cè)器:氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)。毛細(xì)管色譜柱:DB －5ms UI 30 m ×0．25 mm，膜厚0．25 μm。

1．2．2 超聲介質(zhì)對(duì)反應(yīng)的影響

超聲介質(zhì)的種類對(duì)反應(yīng)的影響:在50 mL的錐形瓶中，加入卵磷脂 1．000 0 g，魚(yú)油 2．10 mL(合2．00 g)，脂肪酶 Lipozyme TL IM 0．600 0 g(加水量為脂肪酶質(zhì)量的1%)，分別以異辛烷、正庚烷、正已烷為超聲介質(zhì)，45℃、超聲功率60 W下輻照3．5 h，通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物中DHA－EPA的含量確定最適溶劑。

不同超聲介質(zhì)復(fù)配對(duì)反應(yīng)的影響:以選擇出的最適超聲介質(zhì)為主溶劑，另兩種為助溶劑(其他條件不變)，考察不同溶劑比例的變化對(duì)反應(yīng)的影響，從中篩選出一種最具效率而毒性較小的反應(yīng)溶劑。

超聲介質(zhì)添加量對(duì)反應(yīng)的影響:以篩選出的最佳超聲介質(zhì)復(fù)配比例混合溶劑，并以混合溶劑(mL)與底物(g)之比分別為 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5的比例進(jìn)行試驗(yàn)(其他條件不變)，以確定最適超聲介質(zhì)添加量。

1．2．3 連續(xù)超聲時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

在最適超聲介質(zhì)中設(shè)定 1．5、2．5、3．5、4．5、5．5、6．5 h為時(shí)間研究變量(其他條件不變)，考察連續(xù)超聲時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響。

1．2．4 超聲功率對(duì)反應(yīng)的影響

在最適超聲介質(zhì)中設(shè)定 50、60、70、80、90 W 為超聲功率研究變量(其他條件不變)，考察超聲功率對(duì)反應(yīng)的影響。

1．2．5 超聲介質(zhì)中水分含量對(duì)反應(yīng)的影響

在最適超聲介質(zhì)中，設(shè)定加水量(以水分與脂肪酶的質(zhì)量比計(jì)算)在0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%為研究變量(其他條件不變)，考察水分含量對(duì)反應(yīng)的影響。

1．2．6 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

在最適超聲介質(zhì)中，設(shè)定 45、50、55、60、65 ℃為溫度研究變量(其他條件不變)，考察溫度對(duì)反應(yīng)的影響。

1．2．7 酶用量對(duì)反應(yīng)的影響

在最適超聲介質(zhì)中設(shè)定5%、10%、15%、20%、25%、30%(以酶與底物的質(zhì)量比計(jì)算)為酶用量研究變量(其他條件不變)，考察酶用量對(duì)反應(yīng)的影響。

2 結(jié)果與討論

2．1 超聲介質(zhì)對(duì)反應(yīng)的影響

2．1．1 超聲介質(zhì)的種類對(duì)反應(yīng)的影響

有機(jī)溶劑的疏水性是影響酶穩(wěn)定性的重要因素之一，一般說(shuō)來(lái)，在疏水性較強(qiáng)的介質(zhì)中，因不易奪取維持酶分子構(gòu)象的必需水，從而使酶具有較高的反應(yīng)活性，符合 Laane提出的 log P(疏水常數(shù))規(guī)則［4］。本研究選用異辛烷、正庚烷、正已烷等3種疏水性較強(qiáng)的溶劑為酶反應(yīng)介質(zhì)，其log P排列順序是異辛烷＞正庚烷＞正已烷。結(jié)果顯示(表1)，以正庚烷為介質(zhì)的反應(yīng)體系所得到的產(chǎn)物中DHA－EPA總含量最高，這一結(jié)果不完全符合3種溶劑的log P值排列順序，說(shuō)明疏水性只是溶劑的特性之一，溶劑對(duì)酶反應(yīng)活性的影響是復(fù)雜的，不僅與疏水性相關(guān)，也與溶劑對(duì)酶構(gòu)象的改變、溶劑分子與酶活性中心的結(jié)合等因素都有關(guān)系［5，6］。

表1 不同溶劑對(duì)反應(yīng)的影響

2．1．2 不同超聲介質(zhì)復(fù)配對(duì)反應(yīng)的影響

有機(jī)溶劑的疏水性不僅影響有機(jī)相酶反應(yīng)的酶活性，也影響酶選擇性，且更為復(fù)雜，與酶在溶劑中的構(gòu)象變化以及酶、底物、溶劑三者之間的相互作用等均有關(guān)系。為使酶既獲得高活性，又有高選擇性，本研究以正庚烷為主溶劑，異辛烷、正已烷為助溶劑，考察了不同溶劑按體積比組合后的反應(yīng)效率(表2)，結(jié)果顯示，按一定體積比復(fù)配溶劑反應(yīng)效率比單一溶劑有所提高，其中以正庚烷∶異辛烷∶正已烷 =8∶1∶1(體積比)時(shí)反應(yīng)效率最高，這表明，在此條件下，酶的疏水性與選擇性達(dá)到最佳，可作為后續(xù)研究的反應(yīng)溶劑。

表2 溶劑復(fù)配對(duì)反應(yīng)的影響

2．1．3 超聲介質(zhì)添加量對(duì)反應(yīng)的影響

溶劑作為超聲介質(zhì)，在有機(jī)相酶反應(yīng)中可以促使底物溶解，使酶與底物充分接觸以提高反應(yīng)效率。但溶劑添加過(guò)多，也會(huì)使底物稀釋，降低反應(yīng)效率。以正庚烷∶異辛烷∶正已烷=8∶1∶1為溶劑，不同的溶劑(mL)與底物(g)之比進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示(圖1):當(dāng)溶劑/底物＜2．0時(shí)，由于接觸面積不斷擴(kuò)大，反應(yīng)效率隨著溶劑的增加而提高，且在溶劑/底物=2．0時(shí)達(dá)到最佳。而隨著溶劑量的繼續(xù)增加，由于底物不斷被稀釋，反應(yīng)效率也逐漸降低。

圖1 溶劑添加量對(duì)反應(yīng)的影響

2．2 單因素試驗(yàn)

2．2．1 連續(xù)超聲時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

在正庚烷∶異辛烷∶正已烷 =8∶1∶1，溶劑/底物 =2的反應(yīng)體系中，以不同的連續(xù)超聲時(shí)間為研究變量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示(圖2):在連續(xù)超聲時(shí)間低于4．5 h時(shí)，產(chǎn)物中DHA－EPA含量快速上升，當(dāng)連續(xù)超聲時(shí)間為5．5 h時(shí)，產(chǎn)物中DHA－EPA含量上升速度趨緩，當(dāng)連續(xù)超聲時(shí)間達(dá)到6．5 h時(shí)，上升速度進(jìn)一步趨緩，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用使酶活力下降或反應(yīng)達(dá)到平衡所致?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)以反應(yīng)時(shí)間5．5 h為宜。

圖2 連續(xù)超聲時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

2．2．2 超聲功率對(duì)反應(yīng)的影響

分別設(shè)定不同的超聲功率，考察了超聲功率對(duì)反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示(圖3)，超聲功率對(duì)反應(yīng)的影響較大，在低強(qiáng)度的超聲輻照下，隨功率的增大，酶被逐漸激活，在功率為70 W時(shí)，產(chǎn)物中DHAEPA含量達(dá)到最高，而進(jìn)一步提高超聲功率，酶活急劇下降，導(dǎo)致產(chǎn)物中DHA－EPA含量也快速降低。

圖3 超聲功率對(duì)反應(yīng)的影響

2．2．3 超聲介質(zhì)中水分含量對(duì)反應(yīng)的影響

在有機(jī)介質(zhì)中，微量水對(duì)維持酶的構(gòu)象以及發(fā)揮酶催化作用是必需的，體系中含水量過(guò)低，酶構(gòu)象變得過(guò)于“剛性”，而抑制酯交換反應(yīng);但含水量過(guò)高時(shí)，酶結(jié)構(gòu)的“柔性”過(guò)大，會(huì)引起酶結(jié)構(gòu)的改變，甚至導(dǎo)致酶失活。只有嚴(yán)格控反應(yīng)體系中的水分，使酶的“剛性”與“柔性”達(dá)到一個(gè)平衡點(diǎn)，才能發(fā)揮酶的最大活力。對(duì)于固定化酶Lipozyme TL IM來(lái)說(shuō)，水分含量過(guò)高，還可能使固定在硅膠上的脂肪酶溶解，因而特定的反應(yīng)需要確定其最佳水分含量。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)加水量從0%至2%時(shí)，產(chǎn)物中DHAEPA含量增加，當(dāng)加水量大于2%時(shí)，產(chǎn)物中DHAEPA含量呈下降趨勢(shì)，可見(jiàn)Lipozyme TL IM參加的酶反應(yīng)所需水分很少，這可能與其自身所含的水分較大有關(guān)。

圖4 超聲介質(zhì)中水分含量對(duì)反應(yīng)的影響

2．2．4 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

Lipozyme TL IM的耐熱性較強(qiáng)，即使在70℃下短時(shí)間內(nèi)也有較大的活性，但考慮到長(zhǎng)時(shí)間高溫易引起酶的失活，不利于酶的循環(huán)利用，而且高溫也會(huì)促使含有多個(gè)雙鍵的DHA、EPA等底物發(fā)生氧化反應(yīng)，故在45～65℃溫度范圍內(nèi)探尋適宜溫度，結(jié)果表明(圖 5)，在反應(yīng)溫度低于 55℃時(shí)，產(chǎn)物中DHA－EPA含量快速上升，當(dāng)反應(yīng)溫度高于55℃時(shí)趨于平緩，如增加反應(yīng)時(shí)間，則DHA－EPA含量有所下降，故選擇55℃作為后續(xù)試驗(yàn)的最適溫度。

圖5 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

2．2．5 酶用量對(duì)反應(yīng)的影響

在酯化反應(yīng)中，國(guó)內(nèi)外研究較多的成品酶是固定化Novozym 435，其催化速率快，產(chǎn)率高，但成本也高，不利于工業(yè)化，而固定化脂肪酶Lipozyme TL IM價(jià)格低，但酶活性較低，用量較大，通常和Novozym 435混合使用，以降低成本［7］。本研究在反應(yīng)體系中分別加入5%、10%、15%、20%、25%、30%的固定化脂肪酶 Lipozyme TL IM，結(jié)果顯示(圖6):初始時(shí)(5%、10%)加酶量少(5% ～10%)，酶不能充分催化底物，產(chǎn)物中DHA－EPA含量增加緩慢，當(dāng)加酶量達(dá)到15% ～25%時(shí)，DHA－EPA含量增加顯著，當(dāng)加酶量達(dá)到30%時(shí)，DHA－EPA含量增加再次趨緩，說(shuō)明這時(shí)酶分子已基本飽和反應(yīng)界面。為節(jié)約成本，酶用量應(yīng)以25%為宜。

圖6 酶用量對(duì)反應(yīng)的影響

2．3 酯交換前后磷脂的脂肪酸組成分析

對(duì)原料大豆卵磷脂及最佳工藝條件下酯交換磷脂產(chǎn)品進(jìn)行GC/MS分析，圖7顯示:原料大豆卵磷脂由棕櫚酸(15．81%)、亞油酸(38．34%)、油酸(30．86%)、硬脂酸(6．37%)、亞麻酸(8．62%)等組成。由圖8可知，酯交換后磷脂產(chǎn)品由棕櫚酸(14．45%)、亞油酸(25．84%)、油酸(22．90%)、硬脂酸(5．81%)、亞麻酸(8．01%)、EPA(14．58%)、DHA(8．41%)等組成，即交換到大豆卵磷脂上的EPA及DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為22．99%。

3 結(jié)論

綜合以上單因子試驗(yàn)的最佳條件，即在正庚烷∶異辛烷∶正已烷 =8∶1∶1為超聲介質(zhì)，溶劑/底物 =2，酶用量為25%，超聲介質(zhì)中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，超聲功率70 W，55℃下連續(xù)超聲5．5 h，可獲得DHA－EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22．99%。由此可見(jiàn)，通過(guò)超聲輔助及酯交換條件的優(yōu)化，不僅可以大大縮短反應(yīng)所需的時(shí)間，而且也能充分激活Lipozyme TL IM的酶活力，從而提高酯化反應(yīng)的效率，但本研究中最適酶用量為底物質(zhì)量的25%，需求量較大，若應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)還需進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，以降低成本。

［1］潘麗，谷克仁，楊壯．制備富含n－3多不飽和脂肪酸的磷脂［J］．糧油加工，2006，(12):57－60．

［2］金華麗，谷克仁．脂肪酶催化大豆磷脂改性的研究［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(7):33－36．

［3］寇秀穎，于國(guó)萍．脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究［J］．食品研究與開(kāi)發(fā)，2005，26(2):46－47．

［4］Laane C，Boeren S，Vos K，et al．Rule for optimization of biocatalysis in or ganic solvent［J］．Biotec hnol bioeng，1987，30:81－87

［5］Ueji S，F(xiàn)ujio R，Okubo N．Solvent－induced inversion of enantioseletivity in lipase－catalyzed esterification of 2－p henoxypropionic acids［J］．Biotec hnol Letters，1992，14:163 －166

［6］Secundo F，Riva S，Carrea G．Effect of medium an of reaction conditions on the enantioselectivity of lipases in or ganic solvent an possible rationales［J］．Tetra hedron:Asymmetry，1992(3):267－269

［7］Lilin Li，Wei Du，Dehua Liu，et a1．Lipase—catalyzed transesterifieation of rapeseed oils for biodiesel production with a novel or ganic solvent as the reaction medium［J］．Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2006，43:58－62．

Assistant of Ultrasonic Irradiation Synthesize Phospholipids Enriched with n－3 Polyunsaturated Fatty Acids by Lipase

Zhan Zhonggen
(Zhejiang Economic＆ Trade Polytechnic，Hangzhou 310018)

The optimum reaction conditions of synthesized phospholipids enriched with n－3 polyunsaturated fatty acids by Lipase(Lipozyme TL IM)were studied．Results showed that:mixed solvent proportion(n－h(huán)eptane:iso－octane:hexane)was 8∶1∶1(V/V/V)，solvent and substrate ratio was 2∶1，Lipozyme TL IM addition was 25%，water content of organic solvent was 2%，power of Ultrasonic Irradiation reaction was 70 W，temperature was 55 ℃ and reaction time was5．5 h．Under the optimum conditions of transesterification，the incorporation of EPA and DHA was 22．99%．This showed that the reaction time was reduced and the activity of Lipozyme TL IM was enhanced greatly by assistance of ultrasonic irradiation and optimum conditions of transesterification．

assistance by ultrasonic irradiation，lipase，n－3 polyunsaturated fatty acids

TS201．2

A

1003－0174(2011)11－0042－05

2011－02－07

詹忠根，男，1971年出生，副教授，食品生物技術(shù)