發(fā)芽蠶豆富集γ－氨基丁酸的培養(yǎng)液組分優(yōu)化

陳 惠 楊潤強(qiáng) 韓永斌 顧振新

發(fā)芽蠶豆富集γ－氨基丁酸的培養(yǎng)液組分優(yōu)化

陳 惠 楊潤強(qiáng) 韓永斌 顧振新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

以蠶豆為試材，研究谷氨酸鈉(MSG)、CaCl2、和VB6對發(fā)芽蠶豆谷氨酸脫羧酶(GAD)及γ－氨基丁酸(GABA)的影響，采用Box－behnken設(shè)計(jì)對發(fā)芽蠶豆富集GABA的培養(yǎng)液組分進(jìn)行了優(yōu)化，并對發(fā)芽蠶豆富集GABA的二次回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果表明，低氧聯(lián)合鹽脅迫下，MSG、CaCl2和VB6對發(fā)芽蠶豆GAD及GABA的影響均達(dá)到顯著水平(P＜0．005)。經(jīng)過回歸分析建立了GABA含量對培養(yǎng)液組分的二次回歸模型，回歸方程的決定系數(shù)達(dá)到0．976，說明方程能很好的預(yù)測GABA富集含量的變化。蠶豆富集GABA的最適培養(yǎng)液組分為MSG 1．1 mg/mL、CaCl26．1 mmol/L、VB672 μmol/L，此時(shí)，GABA 富集量達(dá)到(1．98 ±0．09)mg/g DW，為對照［(1．08 ±0．01)mg/g DW］的1．83 倍。

發(fā)芽蠶豆 γ－氨基丁酸 富集 優(yōu)化

蠶豆(Vicia faba L．)為豆科野豌豆屬作物，其種子富含蛋白質(zhì)、淀粉、氨基酸、維生素和鉀、鈣、磷等礦物質(zhì)元素［1］。蠶豆種子中豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸可為γ－氨基丁酸(GABA)富集提供充足的底物。GABA具有鎮(zhèn)靜安神、抗焦慮、抗驚厥、降血壓等作用［2］。通常植物組織中GABA含量較低，但受到熱激、鹽害和低氧等逆境脅迫時(shí)，其含量提高幾倍至幾十倍［3］。低氧脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞質(zhì)酸化［4］，使谷氨酸脫羧酶(GAD)活性提高，為GABA的合成提供了條件。鹽脅迫使植物體胞內(nèi)Ca2+濃度升高［5］，CaM(鈣調(diào)素)水平提高，GAD活性增加，從而促進(jìn)GABA積累。因此，低氧脅迫和鹽脅迫是植物源食品富集GABA 的有效方法［6］。Li等［7］研究了溶氧量對發(fā)芽蠶豆富集GABA的影響，但關(guān)于低氧脅迫聯(lián)合鹽脅迫對蠶豆富集GABA的研究未見報(bào)道。本研究考察了蠶豆發(fā)芽過程中，低氧聯(lián)合鹽脅迫處理?xiàng)l件下，MSG、CaCl2和VB6對GAD活性和對GABA富集效果的影響，旨在為蠶豆發(fā)芽富集GABA提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 試驗(yàn)材料

供試蠶豆由江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，品種為啟豆2號(hào)。

γ－氨基丁酸(GABA)標(biāo)準(zhǔn)品:購自Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．1．2 試驗(yàn)儀器

Orion818型pH測試儀:Orion公司;Agilent 1200 Series高效液相色譜儀:Agilent公司;TDL－40B離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國華電器有限公司;PYX－DHS－BS型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Anke GL－20G－Ⅱ冷凍離心機(jī):上海安亭儀器廠;JA2003型電子天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1．2．1 單因素試驗(yàn)

稱取50 g蠶豆，水清洗后，用1%的次氯酸鈉水溶液消毒30 min，然后用蒸餾水洗去殘留的次氯酸鈉。消毒后的蠶豆于蒸餾水中30℃浸泡8 h，取出吸干表面水分，置于托盤中(33±1)℃避光培養(yǎng)1．5 d。取出后置于具塞培養(yǎng)瓶(φ6 cm×9 cm)中，加入60 mmol/L的NaCl溶液(用10 mmol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液配制，pH 3．5)200 mL，于(33±1)℃下避光培養(yǎng)4 d。期間，向培養(yǎng)液中連續(xù)通入空氣，通氣量為1．2 L/min，形成低氧聯(lián)合鹽脅迫條件。

培養(yǎng)液中谷氨酸鈉(MSG)為0～2．5 mg/mL、CaCl2為0～15 mmol/L、VB6為0～150 μmol/L。

1．2．2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以MSG濃度(A)、CaCl2濃度(B)和VB6濃度(C)3個(gè)因素與GABA含量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，優(yōu)化培養(yǎng)液組分。通過Design Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測發(fā)芽蠶豆富集GABA的最優(yōu)培養(yǎng)液組成。以pH 3．5檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液培養(yǎng)為對照。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

1．3 測定指標(biāo)與方法

GABA含量:參照Bai［8］的方法測定;GAD活性:參照 Li［7］的方法測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 MSG對發(fā)芽蠶豆GABA含量和GAD活性的影響

由表2可見，當(dāng)MSG質(zhì)量濃度低于1．0 mg/mL時(shí)，發(fā)芽蠶豆GABA含量隨著MSG質(zhì)量濃度的增加而增加，MSG大于1．0 mg/mL時(shí)，GABA含量隨MSG質(zhì)量濃度升高而降低。MSG質(zhì)量濃度在1．0～2．0 mg/mL時(shí)，GABA含量差異不顯著。因此，本研究選擇MSG質(zhì)量濃度為1．0 mg/mL。GAD活性變化趨勢與GABA含量變化相似。當(dāng)MSG質(zhì)量濃度為1．0 mg/mL時(shí)，GAD活性最高，為對照的1．43倍。谷氨酸和谷氨酸鈉(MSG)在GAD作用下轉(zhuǎn)化為GABA，其含量增多可使GABA支路中碳流量增加，并調(diào)節(jié)GAD 活性［9］。王玉萍等［10］研究表明，添加 MSG 對發(fā)芽糙米GABA的富積影響不顯著。本研究與之報(bào)道不一致，原因尚有待探討。

2．2 CaCl2對發(fā)芽蠶豆GABA含量和GAD活性的影響

植物GAD氨基酸序列中C末端存在CaM結(jié)合區(qū)，該區(qū)域與Ca2+/CaM結(jié)合后可提高GAD活性［3］。低氧條件下，添加Ca2+后，發(fā)芽粟谷中GAD活性得以提高，因而GABA含量提高［8］。由表3可知，隨著CaCl2濃度的增加，發(fā)芽蠶豆GAD活性和GABA含量均呈先升高后降低的變化趨勢。當(dāng)CaCl2濃度為6 mmol/L時(shí)，GAD活性和GABA含量均達(dá)到最大值，分別為對照的1．88倍和1．09倍。這一研究結(jié)果也證實(shí)了培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度的CaCl2可提高蠶豆GAD活性和GABA含量。

2．3 VB6對發(fā)芽蠶豆 GABA含量合 GAD活性的影響

發(fā)芽蠶豆GABA含量隨VB6濃度增加呈先升后降的趨勢(表4)。

表2 MSG對發(fā)芽蠶豆GABA含量和GAD活性的影響

表3 CaCl2對發(fā)芽蠶豆GABA含量和GAD活性的影響

表4 VB6對發(fā)芽蠶豆GABA含量和GAD活性的影響

VB6濃度為60～120μmol/L時(shí)，GAD活性無顯著差異，而VB6濃度為60μmol/L時(shí)，GABA含量達(dá)到最大值，是對照的1．35倍。VB6是磷酸吡哆醛(PLP)的前體物質(zhì)，而PLP是GAD的輔基，適量添加PLP可促進(jìn)其與脫輔基蛋白結(jié)合而激活GAD，促進(jìn)MSG脫羧生產(chǎn)GABA，從而增加GABA含量［11］。張磊等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在米糠孵育液中添加 VB6，可使GABA含量得到提高，本研究結(jié)果與此一致。

2．4 低氧聯(lián)合鹽脅迫下發(fā)芽蠶豆GABA富集的培養(yǎng)液組分優(yōu)化

2．4．1 模型分析

對MSG濃度(A)、CaCl2濃度(B)和 VB6濃度(C)進(jìn)行了三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5。利用Design Expert軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到GABA含量對編碼自變量A、B和C的二次多項(xiàng)回歸方程:

y=1．181 15+0．525 00A+0．011 592C+1．875 000 AC－0．000 450BC－0．291 41A2－0．028 222B2－0．000 076 6C2

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

對上述回歸模型進(jìn)行方差分析(表6)。結(jié)果表明，模型是顯著的(P＜0．001)，回歸模型的決定系數(shù)為0．976，說明該模型能夠解釋97．6%的變異。因此，可用此模型對GABA含量進(jìn)行分析和預(yù)測。

表6 回歸模型方差分析

2．4．2 發(fā)芽蠶豆富集GABA培養(yǎng)液組分優(yōu)化

利用Design Expert軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程響應(yīng)曲面對應(yīng)的等高線見圖1～圖2。

圖1顯示，CaCl2濃度為6 mmol/L時(shí)，MSG和VB6對發(fā)芽蠶豆GABA含量的交互作用顯著。因?yàn)榈雀呔€的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著［12］。VB6濃度一定時(shí)，GABA含量隨MSG濃度增加先升高后降低。VB6濃度較低(10～35μmol/L)時(shí)，圖1中等高線分布較密，表明此時(shí)MSG濃度對GABA含量的影響較大。當(dāng)MSG濃度為1．1 mg/mL，VB6濃度為72 μmol/L 時(shí)，GABA含量達(dá)到最高值。MSG是GAD作用的底物，添加適量的MSG可以提高GAD活性，增加GABA含量。

圖1 MSG和VB6的交互作用對GABA含量的影響

CaCl2和VB6對發(fā)芽蠶豆GABA含量的交互作用顯著(圖2)。與VB6相比，CaCl2濃度對GABA含量的影響較大。當(dāng)CaCl2濃度一定時(shí)，GABA含量隨VB6濃度增加呈逐漸升高的趨勢。CaCl2為 6．1 mmol/L，VB6濃度為72μmol/L時(shí)，GABA含量達(dá)到峰值。由此可見，培養(yǎng)液添加適當(dāng)濃度的CaCl2和VB6可提高發(fā)芽蠶豆中GABA含量。

圖2 CaCl2和VB6的交互作用對GABA含量的影響

Glu是GABA的前體物之一，而MSG是Glu的鹽存在形式，其在水溶液中解離后，滲入蠶豆種子，從而被發(fā)芽過程中所激活的GAD降解產(chǎn)生GABA;植物GAD氨基酸序列中C末端存在CaM結(jié)合區(qū)，該區(qū)域與Ca2+/CaM結(jié)合后可提高GAD活性，在足夠多的底物存在的情況下，從而提高GABA產(chǎn)率;PLP是GAD的輔酶，VB6與PLP結(jié)構(gòu)相似，可起到輔酶功能，在蠶豆發(fā)芽過程中參與GAD的合成，提高GAD活力，促進(jìn)Glu脫羧形成GABA，從而使GABA含量增加。

目前報(bào)道，GABA的形成有兩條途徑，即GABA支路和多胺氧化降解途徑［13］。其中GABA支路對發(fā)芽蠶豆GABA富集的貢獻(xiàn)約占70%(數(shù)據(jù)未展示)。在GABA支路中，GAD活力的提高和足夠的底物(MSG)對GABA的產(chǎn)生必不可少，而VB6是GAD輔酶的結(jié)構(gòu)類似物，參與酶的合成來提高GAD活力。所以，MSG和VB6的加入對GABA的形成具有協(xié)同作用。作為第二信使，Ca2+通過信號(hào)傳遞的方式與VB6共同調(diào)節(jié)GAD活力，對GABA的產(chǎn)生具有協(xié)同作用。

2．4．3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

對發(fā)芽蠶豆GABA含量的二次多項(xiàng)模型解逆矩陣后得出，在低氧聯(lián)合鹽脅迫培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液組分中MSG 質(zhì)量濃度為 1．1 mmol/L、CaCl2濃度6．1 mmol/L、VB6濃度72μmol/L時(shí)，發(fā)芽蠶豆中GABA富集量的預(yù)測值為2．01 mg/g DW，實(shí)測值為(1．98±0．09)mg/g DW，是對照［(1．08 ±0．01)mg/g DW］的1．83倍，且高于隨機(jī)選擇組。相關(guān)性分析表明，實(shí)測值與預(yù)測值接近，表明實(shí)驗(yàn)所擬合的模型可用來預(yù)測培養(yǎng)液組分和試驗(yàn)響應(yīng)值之間的關(guān)系(表7)。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

3 結(jié)論

低氧聯(lián)合鹽脅迫下，培養(yǎng)液中3種組分(MSG、CaCl2和VB6)對發(fā)芽蠶豆GAD活性和GABA含量的影響均達(dá)到顯著水平(P＜0．005)。當(dāng)MSG質(zhì)量濃度為 1．1 mg/mL、CaCl2濃度為 6．1 mmol/L、VB6濃度為72μmol/L時(shí)，發(fā)芽蠶豆中GABA富集量是對照［(1．08 ±0．01)mg/g DW］的1．83 倍，達(dá)到(1．98 ±0．09)mg/g DW。

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Optimization of Culture Solution Compositions for γ－aminobutyric Acid Accumulation in Germinated Fava Beans(Vicia faba L．)

Chen Hui Yang Runqiang Han Yongbin Gu Zhenxin
(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095)

In this paper，the effects of MSG，CaCl2and VB6on glutamate decarboxylase(GAD)andγ－aminobutyric acid(GABA)of germinated fava beans were investigated．The culture solution compositions used for GABA accumulation in fava beans were optimized with Box－Behnken design．The results showed that under the condition of hypoxia combined with salt stress，the effects of MSG，CaCl2and VB6on GAD and GABA of germinated fava beans all reached significant levels(P ＜0．005)．The quadric regression equation was established between GABA content and culture solution compositions．The R－squared reached 0．976，which meant that the equation could predict the changes of accumulation contents of GABA well．The optimum compositions of culture solution for GABA accumulation were MSG of 1．1 mg/mL，CaCl2of 6．1 mmol/L and VB6of 72 μmol/L．Under these conditions，the content of GABA was(1．98 ±0．09)mg/g DW，which was 1．83 times as much as that of the control［(1．08 ±0．01)mg/g DW］．

germinated fava beans，γ － a minobutyric acid，accumulation，optimization

A

1003－0174(2011)11－0027－05

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(KYZ200 917)

2011－01－26

陳惠，女，1986年出生，碩士，食品中功能成分的富集技術(shù)

顧振新，男，1956年出生，教授，博士生導(dǎo)師，生物技術(shù)與功能食品