響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉胞外多糖提取工藝

汪鵬榮 蔡琪敏 崔宇輝 蔣冬花 陳丹鳳

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉胞外多糖提取工藝

汪鵬榮 蔡琪敏 崔宇輝 蔣冬花 陳丹鳳

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

對(duì)實(shí)驗(yàn)室自行分離得到的紫色紅曲霉MP－66發(fā)酵液中的胞外多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高胞外多糖的產(chǎn)量。通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時(shí)間、發(fā)酵濾液pH對(duì)紅曲霉胞外多糖的得率的影響，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box－Behnken中心組合試驗(yàn)及響應(yīng)面法分析對(duì)紅曲霉胞外多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，結(jié)果表明:乙醇沉淀時(shí)間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH為8.05，在此條件下紅曲霉胞外多糖得率可達(dá)7.40 g/L。

胞外多糖 提取工藝 單因素試驗(yàn) 響應(yīng)面分析法

紅曲霉是一類(lèi)十分重要的藥用真菌，紅曲霉發(fā)酵制成的中藥紅曲具有活血化瘀、健脾消食等功效及降脂、降壓、降糖和抗腫瘤等作用［1］，在食品、色素、中藥等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，隨之紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物也成為研究焦點(diǎn)。近年來(lái)，日本、美國(guó)、韓國(guó)等眾多學(xué)者專(zhuān)家對(duì)紅曲進(jìn)行了廣泛而深入的研究，并取得了令人矚目的成果。

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由10個(gè)分子以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，是一類(lèi)可以控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老的活性多糖，是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)［2］。己在國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、靈芝多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖等［3］。多糖類(lèi)物質(zhì)是紅曲霉的一種重要次生代謝產(chǎn)物，已有研究表明紅曲多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等多種生物學(xué)功能［4－6］。目前國(guó)內(nèi)研究主要是通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化提高紅曲霉胞外多糖產(chǎn)量［7－9］，但通過(guò)胞外多糖提取條件優(yōu)化進(jìn)而提高多糖產(chǎn)量的方法還未見(jiàn)報(bào)道。響應(yīng)面法(Response Surface Method，RSM)是一種優(yōu)化提取工藝條件的有效方法，已被廣泛用于同時(shí)存在多因素影響的試驗(yàn)優(yōu)化［10］，其中在微生物多糖和植物多糖的提取研究中應(yīng)用得較為廣泛［11－14］，但在紅曲霉胞外多糖的提取工藝研究方面鮮有報(bào)道。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉胞外多糖提取工藝參數(shù)，可為后續(xù)紅曲霉胞外多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉(Monascus purpureus)MP－66分離自浙江溫州采集的紅曲米。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA 培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 自然。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖 50 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 1 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 000 mL，pH 6.0。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，KH2PO4·3H2O 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，培養(yǎng)基起始 pH 5.5。

施工中嚴(yán)格控制泥漿的密度、粘度、含砂量。造孔過(guò)程中，始終保持孔內(nèi)泥漿面在導(dǎo)墻頂面下30～50cm，以防塌孔。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

用打孔器(直徑0.8 cm)分別取30℃培養(yǎng)5 d的平板菌種(5塊)接種到種子培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝入50 mL液體培養(yǎng)基)，在30℃下，轉(zhuǎn)速200 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)48 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將上述種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為 8%，250 mL三角瓶裝 100 mL培養(yǎng)液，200 r/min，30 ℃培養(yǎng)96 h。

1.3.3 紅曲霉胞外多糖的提取方法［7，15］

將培養(yǎng)96 h的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，發(fā)酵濾液定容至100 mL，取發(fā)酵濾液20 mL加入80 mL無(wú)水乙醇中，在5℃下靜置過(guò)夜、離心，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗，最后在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重，稱(chēng)量即為胞外多糖的含量。

1.3.4 多糖提取的單因素試驗(yàn)

按照乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時(shí)間、發(fā)酵濾液pH提取紅曲霉胞外多糖，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均多糖得率。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時(shí)間、發(fā)酵濾液pH的3個(gè)水平，按Box－Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，并利用響應(yīng)面法對(duì)紅曲霉胞外多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇沉淀時(shí)間對(duì)紅曲霉胞外多糖得率的影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 7.0，分別選取乙醇沉淀時(shí)間為4、8、12、16、20 h進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定多糖得率。由圖1可知，隨著乙醇沉淀時(shí)間的增加，胞外多糖得率也隨之提高，但是在16 h之后胞外多糖的得率增加不明顯，這是因?yàn)榇嘉鰰r(shí)間過(guò)短，乙醇對(duì)多糖的沉降會(huì)不充分［16］，當(dāng)沉淀時(shí)間達(dá)到16 h時(shí)發(fā)酵液中的絕大部分多糖均已沉淀出來(lái)。因此從時(shí)間成本上考慮選取16 h為紅曲霉胞外多糖的最宜提取時(shí)間。

圖1 乙醇沉淀時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅曲霉胞外多糖得率的影響

設(shè)定乙醇沉淀時(shí)間為20 h，發(fā)酵濾液pH 7.0，分別取20 mL發(fā)酵濾液加入無(wú)水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定多糖得率。由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，胞外多糖得率明顯提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%時(shí)多糖得率呈下降趨勢(shì)。醇沉法提取多糖時(shí)，乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖的提取量影響很大，主要取決于多糖的相對(duì)分子質(zhì)量大小和分子的形狀［17］。紅曲霉胞外多糖在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)提取得率最大，葉明等［18］人的研究也證明乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，黑芝胞外多糖提取得率達(dá)到最大值。因此，紅曲霉胞外多糖提取的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響

2.1.3 發(fā)酵濾液pH對(duì)紅曲霉胞外多糖得率的影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，乙醇沉淀時(shí)間為16 h，分別將發(fā)酵液 pH 調(diào)為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0進(jìn)行單因素試驗(yàn)。由圖3可知，當(dāng)pH小于8.0時(shí)，胞外多糖得率隨發(fā)酵濾液pH的增加而增加，當(dāng)pH超過(guò)8.0時(shí)，多糖得率呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵液中多糖的沉淀量在偏堿性條件下提取量較大，這可能與其分子帶電荷有關(guān)［17］，因此，弱堿性條件(pH 8.0)更有利于紅曲霉胞外多糖的提取。

圖3 發(fā)酵液pH對(duì)多糖提取量的影響

2.2 響應(yīng)面法對(duì)紅曲霉胞外多糖提取條件的優(yōu)化

2.2.1 Box－Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

以紅曲霉胞外多糖得率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行相應(yīng)分析試驗(yàn)，Box－Behnken設(shè)計(jì)每個(gè)因素取3個(gè)水平，以(－1，0，+1)編碼，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值［19］。因素水平如表1所示，表2中12組試驗(yàn)為析因?qū)嶒?yàn)，3組為中心試驗(yàn)。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分別為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)位自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表1 Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

表2 Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸方程建立與方差分析

利用Minitab 15軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到紅曲霉胞外多糖得率(Y)對(duì)乙醇沉淀時(shí)間(X1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2)和發(fā)酵濾液pH(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型為:

Y=0.200X1－0.250X2+0.275X3－0.521X12－0.071X2

2－1.471X32+0.025X1X2－ 0.575X1X3+0.025X2X3+7.267

表3和表4是對(duì)方程的方差和回歸分析結(jié)果。表3可知，模型的一次項(xiàng) X1、X2、X3顯著，其顯著性排序?yàn)閄3＞X2＞X1即單因素對(duì)紅曲霉胞外多糖提取得率的影響大小依次是發(fā)酵濾液pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時(shí)間;二次項(xiàng)X12和X32顯著，X22不顯著;交互項(xiàng)中X1X3顯著，X2X3和X1X2不顯著。由表4 可知 FModel=40.34，P ＜0.001，表明二次多元回歸模型極顯著;P失擬項(xiàng)=0.06 ＞0.05，說(shuō)明模擬失擬不顯著;模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.962，表明方程模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)有96.2%的符合度，該模型有很高的可信度化，可以用此模型對(duì)紅曲霉胞外多糖的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸分析結(jié)果表

表4 方差分析表

2.2.3 紅曲霉胞外多糖提取得率的響應(yīng)面法分析

響應(yīng)面分析的圖形是特定的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖，可以直觀的反映出各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響［20］。圖5、圖6、圖7為因素交互作用的響應(yīng)面和等高線。響應(yīng)面是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大，表現(xiàn)為曲面越陡峭［21］。等高線的形狀，圓形或者橢圓形可以反映出變量之間的相互影響是否顯著，圓形表示兩因素間交互作用不顯著;而橢圓形則顯著［22］。從圖5、圖6、圖7中可以看出，3個(gè)響應(yīng)面均為開(kāi)口向下的凸行曲線，說(shuō)明響應(yīng)值(紅曲霉胞外多糖得率)存在極大值。

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，乙醇沉淀時(shí)間與發(fā)酵濾液pH對(duì)胞外多糖得率的交互作用見(jiàn)圖5。乙醇沉淀時(shí)間一定時(shí)，隨著發(fā)酵液pH的增加，胞外多糖產(chǎn)量逐漸增加，在pH 8.0時(shí)出現(xiàn)極大值，之后隨著pH的增加，胞外多糖得率呈下降趨勢(shì);乙醇沉淀時(shí)間在12～20 h范圍內(nèi)胞外多糖得率變化不太明顯。沿著發(fā)酵濾液pH方向的等高線密度比較大，說(shuō)明濾液pH對(duì)胞外多糖得率的影響大于乙醇沉淀時(shí)間。

圖5 乙醇沉淀時(shí)間與發(fā)酵濾液pH對(duì)胞外多糖得率的響應(yīng)面圖

當(dāng)發(fā)酵濾液pH 8.0時(shí)，乙醇沉淀時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)胞外多糖得率的交互作用見(jiàn)圖6。由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70% ～80%范圍內(nèi)，胞外多糖得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%時(shí)，胞外多糖得率開(kāi)始下降;乙醇沉淀時(shí)間在12～16.5 h范圍內(nèi)時(shí)，胞外多糖得率隨著沉淀時(shí)間的增加而增加，在乙醇沉淀時(shí)間為16.5 h時(shí)達(dá)到最大值。

圖6 乙醇沉淀時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)胞外多糖得率的響應(yīng)面圖

當(dāng)乙醇沉淀時(shí)間16 h時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵濾液pH對(duì)胞外多糖得率的交互作用見(jiàn)圖7。由圖7可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵濾液pH分別控制在80%和8.0之內(nèi)時(shí)，胞外多糖得率隨著二者濃度的增加而增加，而當(dāng)任一因素高于其相應(yīng)濃度時(shí)，胞外多糖得率均將無(wú)法達(dá)到最大值。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵濾液pH對(duì)胞外多糖得率的響應(yīng)面圖

為確定各因素的最佳取值，在選取的各因素范圍內(nèi)利用Minitab 15軟件進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，Y的最大值為7.47 g/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的各因素取值分別為:乙醇沉淀時(shí)間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 8.05。

2.2.4 試驗(yàn)驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件(乙醇沉淀時(shí)間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 8.05)進(jìn)行紅曲霉胞外多糖提取試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，所測(cè)得的紅曲霉胞外多糖得率的平均值為7.40 g/L，與理論最優(yōu)值(7.47 g/L)僅相差0.94%，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)紅曲霉胞外多糖的提取情況，證明此次RSM試驗(yàn)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時(shí)間及發(fā)酵濾液pH對(duì)紅曲霉胞外多糖得率的影響。由響應(yīng)面分析試驗(yàn)得出，乙醇沉淀時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)及發(fā)酵濾液pH是影響多糖得率的主要因素，其中發(fā)酵濾液pH的影響最為顯著。依據(jù)回歸分析確定紅曲霉胞外多糖提取的最佳工藝:乙醇沉淀時(shí)間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 8.05。在此工藝條件下，紅曲霉胞外多糖得率可達(dá)7.40 g/L。由此可見(jiàn)，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化紅曲霉胞外多糖的提取工藝條件在實(shí)踐上是可靠的。

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Optimizing the Extraction Technology of Monascus Exopolysaccharide by Response Surface Methodology

Wang Pengrong Cai Qimin Cui Yuhui Jiang Donghua Chen Danfeng
(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

The extraction conditions for producing exopolysaccharide by Monascus purpureus MP－66 were optimized in order to enhance the extraction yield.Single－factor experiments were carried to investigate the influences of the alcohol volume fraction，the sedimentation time of alcohol，and the pH value of fermentation broth on extraction yield of Monascus exopolysaccharide.On the basis of single － factor experiments，a quadratic polynomial regression equation forecasting model was set up by designing a Box－Behnken central composite experiment involving of three factors and three levels and the method of response surface analysis，thus the optimized extraction conditions for Monascus exopolysaccharide were obtained.According to the results，alcohol sedimentation time was 16.5 h，the alcohol column fraction was 80%，and the pH value of fermentation broth was 8.05.Based on these conditions，the yield of Monascus exopolysaccharide could reach 7.40 g/L.

exopolysaccharide，extraction technology，single factor experiment，response surface methodology

Q939.9

A

1003－0174(2011)12－0083－06

國(guó)家自然科學(xué)基金(31070008)

2011－01－18

汪鵬榮，男，1986年出生，碩士，應(yīng)用微生物

蔣冬花，女，1964年出生，教授，微生物學(xué)和植物病理學(xué)