共軛亞麻酸甲酯化方法的比較和優(yōu)化

袁高峰 陳小娥 李 鐸

(浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院1，舟山 316000)

(浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系2，杭州 310029)

共軛亞麻酸甲酯化方法的比較和優(yōu)化

袁高峰1，2陳小娥1李 鐸2

(浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院1，舟山 316000)

(浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系2，杭州 310029)

氣相色譜分析油脂和生物樣品的脂肪酸時(shí)樣品需要進(jìn)行甲酯化，本研究以富含共軛亞麻酸(CLNA)的栝樓籽油為材料，針對共軛亞麻酸三酰甘油和共軛亞麻酸自由脂肪酸兩種脂質(zhì)形式進(jìn)行了甲酯化方法的優(yōu)化和比較。結(jié)果表明直接以栝樓籽油(三酰甘油形式)采用酸性催化的方法進(jìn)行甲酯化，在高溫和長時(shí)間的反應(yīng)條件下，石榴酸(栝樓籽油含有的主要CLNA)嚴(yán)重異構(gòu)為其他形式的CLNA，而堿性催化的方法進(jìn)行甲酯化，55℃反應(yīng)20 min既能使甲酯化完全，且石榴酸等CLNA保持穩(wěn)定，適宜作為自由脂肪酸含量低的脂質(zhì)的甲酯化方法。而對自由脂肪酸含量高的脂質(zhì)可以采用先以0.3 mol/L氫氧化鉀90%乙醇溶液37℃皂化裂解2 h，再采用1 mol/L硫酸甲醇溶液50℃反應(yīng)10 min進(jìn)行甲酯化。

共軛亞麻酸 氣相色譜(GC) 甲酯化 堿催化 酸催化

油脂和生物樣品的脂肪酸組成一般采用氣相色譜(GC)來進(jìn)行分析。通常，GC分析前，脂肪酸需要轉(zhuǎn)換為它的衍生物。而脂肪酸GC分析中使用最多的脂肪酸衍生物為脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯一般通過酸性或者堿性方法催化而成。

共軛脂肪酸是對具有共軛雙鍵體系的多不飽和脂肪酸位置和立體異構(gòu)體的通稱。共軛脂肪酸可以是雙烯、三烯或四烯的形式，最常見的共軛脂肪酸是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，也就是共軛亞油酸(CLA)和共軛亞麻酸(CLNA)。由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，甲酯化過程中共軛脂肪酸容易產(chǎn)生異構(gòu)，在高溫條件下，含有共軛脂肪酸的脂質(zhì)還會產(chǎn)生雜質(zhì)。到目前為止，已經(jīng)建立了幾種適宜于CLA分析的方法［1－7］。

目前，已發(fā)現(xiàn)石榴酸(9c，11t，13c－ CLNA)、α －桐酸(9c，11t，13t－ CLNA)和梓樹酸(9t，11t，13c －CLNA)等不同構(gòu)型的CLNA廣泛存在于植物種子種，研究報(bào)導(dǎo)CLNA具有細(xì)胞毒性、抑制癌癥形成和改變脂代謝等功能。近來，隨著CLNA越來越多的功能被發(fā)現(xiàn)以及其在體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為CLA，引起了人們對CLNA研究的極大興趣。但對CLNA的分析方面還少有報(bào)導(dǎo)。因此，本研究以栝樓(Trichosanthes kirilowii)籽(富含CLNA的脂質(zhì))為材料，比較不同的甲酯化方法對CLNA的影響，以期建立適宜于CLNA的甲酯化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

栝樓籽購于浙江長興。

1.2 儀器

GC－14C氣相色譜儀:日本島津公司;DB－23毛細(xì)管柱進(jìn)行(60 m ×0.25 mm i.d.，0.25 μm 膜厚度):美國安捷倫科技有限公司。

1.3 栝樓籽油的提取

根據(jù) Floch 等［8］的方法以氯仿∶甲醇(2∶1)萃取。

1.4 共軛亞麻酸三酰甘油甲酯化方法

根據(jù)Park等［6］的方法設(shè)定反應(yīng)方法和條件。

1.4.1 堿催化法

取25 mg純化的栝樓籽油至特福綸試管中，先后加入1 mL甲苯和2 mL 0.5 mol/L甲醇鈉，往特福綸試管充氮?dú)馍w好蓋子，充分振搖，置于水浴中甲酯化，分別設(shè)3個(gè)不同的反應(yīng)溫度(25、55和65℃)和兩個(gè)不同的反應(yīng)時(shí)間(5 min和20 min)。甲酯化反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫。

加入1 mL飽和鹽水和2 mL正己烷，充分振蕩，1 500 r/min的速度離心10 min。吸取上層液于一裝有2 mL蒸餾水的干凈試管中，振搖，靜置后吸取有機(jī)相以無水硫酸鈉吸取水分。

甲酯以Sep－Pak裝置過濾，去除雜質(zhì)后以氮?dú)獯蹈?，加?.1 mL正己烷進(jìn)行GC分析。

1.4.2 硫酸甲醇催化法

取25 mg純化的栝樓籽油至特福綸試管中，先后加入1 mL甲苯和2 mL 1 mol/L硫酸甲醇溶液，往特福綸試管充氮?dú)馍w好蓋子，充分振搖，置于水浴中甲酯化。甲酯化的條件為:4個(gè)不同的反應(yīng)溫度(50、60、80和100℃)和3個(gè)不同的反應(yīng)時(shí)間(20、40和60 min)。甲酯化反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫，脂肪酸甲酯的清洗和過濾等步驟與堿催化法步驟(2)和(3)相同。

1.4.3 三氟化硼甲醇催化法

取25 mg純化的栝樓籽油至特福綸試管中，先后加入1 mL甲苯和2 mL三氟化硼甲醇(BF3－CH3OH)溶液，往特福綸試管充氮?dú)馍w好蓋子，充分振搖，置于水浴中甲酯化。甲酯化的條件為:3個(gè)不同的反應(yīng)溫度(50、60和80℃)和3個(gè)不同的反應(yīng)時(shí)間(20、40和60 min)。甲酯化反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫，脂肪酸甲酯的清洗和過濾等步驟與堿催化法一樣。

1.5 共軛亞麻酸的自由脂肪酸形式甲酯化

對自由脂肪酸含量高的脂質(zhì)可以采取兩步的方法進(jìn)行甲酯化:先皂化裂解，再進(jìn)行甲酯化。

1.5.1 栝樓籽油皂化和自由脂肪酸的制取

根據(jù) Igarashi等［9］的方法進(jìn)行，特福綸管里加90 mg栝樓籽油，加入0.3 mol/L KOH 90%乙醇溶液沖入氮?dú)?5 s，37℃下皂化2 h，冷卻到室溫后，再加入5 mL 90%的甲醇和15 mL正己烷，劇烈震蕩，甲醇水相以15 mL正己烷萃取兩遍以去除不皂部分物質(zhì)，甲醇水相部分加入9 mL 6 mol/L的HCl后以15 mL正己烷提取兩次，即得到自由脂肪酸。

1.5.2 甲酯化

皂化得到的自由脂肪酸采用硫酸甲醇催化法制取脂肪酸甲酯。取溶液1 mL至特福綸試管中，吹干后，先后加入1 mL甲苯和2 mL 1 mol/L硫酸甲醇溶液，往特福綸試管充氮?dú)馍w好蓋子，充分振搖，置于水浴中甲酯化。甲酯化的條件為:兩個(gè)不同的反應(yīng)溫度(50℃和60℃)和兩個(gè)不同的反應(yīng)時(shí)間(10 min和20 min)。甲酯化反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫，脂肪酸甲酯的清洗和過濾等步驟與堿催化法一樣。

1.6 薄層層析(TLC)分析甲酯化的完成情況

用燒杯稱取0.7 g硅膠，加入17 mL蒸餾水后攪拌均勻倒在20 cm×20 cm的玻璃薄層層析板上制備成薄層層析板。薄層層析板室溫晾干，使用之前在100℃的烘箱60 min活化硅膠。點(diǎn)樣后以石油醚∶乙醚(80∶20)作為展開劑展開30 min，取出晾干10 min后，噴硫酸銅顯色劑100℃的烘箱顯色30 min

1.7 氣相色譜分析

脂肪酸甲酯采用帶有火焰離子檢測器的GC－14C氣相色譜儀進(jìn)行，數(shù)據(jù)采集和接收采用N2010色譜工作數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行。脂肪酸的分離采用DB－23毛細(xì)管柱進(jìn)行。色譜條件為:柱箱溫度初始溫度為100℃，保持3 min，以20℃/min的速率上升到190℃，保持10 min，然后以5℃/min的速率程序上升到215℃，保持6 min，最后以10℃/min的速率升溫到230℃，保持5 min。載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣采用分流方式，進(jìn)樣口溫度和檢測器溫度均保持在270℃。脂肪酸通過與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸混合物比較鑒定。

2 結(jié)果與分析

為了通過氣相色譜法定量分析含有CLNA的油脂和生物樣本，樣本必須完全地甲酯化成為脂肪酸甲酯，且在甲酯化過程中不產(chǎn)生雜質(zhì)，盡可能降低共軛亞麻酸異構(gòu)化程度。而含有CLNA的油脂和生物樣本根據(jù)其含有的脂質(zhì)性質(zhì)不同可以分為O－酰基脂質(zhì)如三酰甘油或自由脂肪酸等，本研究以富含CLNA的栝樓籽為材料，針對共軛亞麻酸三酰甘油和共軛亞麻酸自由脂肪酸兩種脂質(zhì)形式進(jìn)行甲酯化方法優(yōu)化和比較。每一個(gè)甲酯化反應(yīng)重復(fù)兩次，各試驗(yàn)結(jié)果取兩次反應(yīng)的平均值計(jì)算。

2.1 共軛亞麻酸三酰甘油甲酯化方法比較

2.1.1 共軛亞麻酸三酰甘油硫酸甲醇催化法

通過TLC檢驗(yàn)硫酸甲醇催化法甲酯化的完成情況表明:50℃反應(yīng)40 min甲酯化不能完全;而延長反應(yīng)時(shí)間或升高反應(yīng)溫度能使甲酯化反應(yīng)完全:50℃反應(yīng)60 min反應(yīng)可以完全，60℃反應(yīng)40 min也能反應(yīng)完全。

表1為不同反應(yīng)條件下硫酸甲醇催化法脂肪酸的組成。隨著反應(yīng)溫度升高和反應(yīng)時(shí)間的延長，異構(gòu)化程度增加，在栝樓籽油中還檢測到未知構(gòu)型的CLNA，圖1為硫酸甲醇催化法甲酯化典型的氣相色譜圖，從圖1可以看出，隨著反應(yīng)溫度升高和反應(yīng)時(shí)間的延長，有新的未知結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體出現(xiàn);另外硫酸甲醇催化法甲酯化過程中還有雜質(zhì)的出現(xiàn)。在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的提高，栝樓籽油中石榴酸的含量降低，而石榴酸的異構(gòu)體(α－桐酸和梓樹酸)含量增加，石榴酸與α－桐酸的比率降低(表1)，這表明硫酸甲醇催化法進(jìn)行甲酯化隨著反應(yīng)溫度升高，發(fā)生異構(gòu)化的程度越嚴(yán)重。在一定的反應(yīng)溫度下，異構(gòu)化的嚴(yán)重程度隨反應(yīng)時(shí)間而增加。

表1 硫酸甲醇催化甲酯化栝樓籽油脂肪酸組成(n=2)

圖1 硫酸甲醇催化法甲酯化典型的氣相色譜圖(n=2)

2.1.2 共軛亞麻酸三酰甘油BF3甲醇催化法

通過TLC檢驗(yàn)BF3－CH3OH催化法甲酯化的完成情況表明50℃反應(yīng)長達(dá)60 min也不能完全完成，而在60℃下反應(yīng)60 min甲酯化才能完全，提高反應(yīng)溫度到80℃時(shí)，反應(yīng)也需要40 min反應(yīng)才能完全。因?yàn)閺牧蛩峒状即呋柞セ那闆r來看，酸催化法在100℃反應(yīng)時(shí)異構(gòu)化比較嚴(yán)重，BF3－CH3OH催化法甲酯化方法比較時(shí)，我們只調(diào)查50、60和80℃三個(gè)反應(yīng)溫度下的情況。

表2為BF3－CH3OH催化甲酯化時(shí)栝樓籽油脂肪酸組成情況。在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的提高，檢測到的石榴酸含量顯著降低;而對于α－桐酸來說，在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)在60℃含量最低，相應(yīng)地石榴酸與α－桐酸的比率在60℃時(shí)最大;而梓樹酸的含量也呈現(xiàn)增加趨勢，雖然隨著溫度的升高α－桐酸和石榴酸與α－桐酸的比率的變化并沒有像硫酸甲醇催化法甲酯化一樣呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，但總的趨勢來說催化法BF3－CH3OH進(jìn)行甲酯化隨著反應(yīng)溫度升高，發(fā)生異構(gòu)體的程度也越嚴(yán)重。

在一定的反應(yīng)溫度下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，石榴酸的含量下降，其他CLNA的異構(gòu)體含量增加，這表明隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，異構(gòu)化嚴(yán)重程度增加。隨著反應(yīng)溫度升高和反應(yīng)時(shí)間的延長，異構(gòu)化程度的增加，在栝樓籽油中還檢測到未知構(gòu)型的CLNA，同時(shí)在BF3－CH3OH催化甲酯化過程中還檢測到雜質(zhì)的出現(xiàn)。

2.1.3 共軛亞麻酸三酰甘油堿法催化法

表3為栝樓籽油在不同反應(yīng)溫度和時(shí)間下甲醇鈉堿法催化甲酯化時(shí)脂肪酸組成。與酸法甲酯化相比，堿法催化甲酯化對CLNA的異構(gòu)化和氧化嚴(yán)重程度要小得多。25℃下反應(yīng)20 min能使甲酯化反應(yīng)完全，而與25℃相比，55℃下甲酯化反應(yīng)石榴酸并不產(chǎn)生明顯地異構(gòu)體和氧化，隨著溫度升高，石榴酸異構(gòu)化程度有所增加(表3)。因此，對含有磷脂、糖脂等成分的脂質(zhì)，為確保反應(yīng)完全，55℃反應(yīng)20 min是理想的選擇。

表2 3 3 催化甲酯化時(shí)栝樓籽油脂肪酸組成(n=2)

表3 堿催化法BF3－CH3OH催化甲酯化時(shí)栝樓籽油脂肪酸組成(n=2)

2.2 共軛亞麻酸自由脂肪酸形式的甲酯化

栝樓籽油經(jīng)過皂化得到自由脂肪酸，栝樓籽油主要為三酰甘油，其皂化程度通過TLC檢驗(yàn)，經(jīng)過反應(yīng)，栝樓籽油能完全皂化。

自由脂肪酸采取硫酸甲醇催化法進(jìn)一步甲酯化，表4為不同反應(yīng)條件下脂肪酸組成。50℃下反應(yīng)5 min和10 min對CLNA的構(gòu)型異構(gòu)化影響較小，石榴酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為32.00%和31.40%與堿法一步法甲酯化栝樓籽油的結(jié)果接近，而60℃下反應(yīng)5 min使CLNA的構(gòu)型嚴(yán)重異構(gòu)化，石榴酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低到26.38%;但TLC檢驗(yàn)結(jié)果表明，50℃下反應(yīng)5 min不能使甲酯化完全，而反應(yīng)10 min后甲酯化能完全完成。因此對自由脂肪酸含量較高的脂質(zhì)，采用兩步法進(jìn)行甲酯化是較為理想的選擇，脂質(zhì)皂化后采用硫酸甲醇在相對低的溫度(50℃)反應(yīng)相對短的時(shí)間(10 min)催化進(jìn)行。

3 討論和結(jié)論

自由脂肪酸能在過量的無水甲醇環(huán)境中以酸作為催化劑酯化形成甲酯，而O－?；|(zhì)如三酰甘油和磷脂等能在大量過量的無水甲醇環(huán)境中以酸作為催化劑通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)而形成甲酯。常見的酸性催化劑為硫酸，鹽酸和BF3。而O－?；|(zhì)如三酰甘油等脂質(zhì)還可以采用堿性催化的方法通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成甲酯，在無水甲醇環(huán)境中，以堿作為催化劑，三酰甘油、磷脂等可以迅速地轉(zhuǎn)酯形成甲酯，反應(yīng)的速度比酸性催化劑快得多，常用的堿性催化劑為甲醇鈉，但自由脂肪酸不能采用這種方法來制備甲酯。

本研究以栝樓籽油(含有CLNA的脂質(zhì))為材料，比較研究酸催化法和堿催化法對CLNA的影響。研究結(jié)果表明直接以栝樓籽油(O－?；|(zhì)三酰甘油形式)采用酸性催化的方法進(jìn)行甲酯化，在高溫和長時(shí)間的反應(yīng)條件下，石榴酸(栝樓籽油含有的主要CLNA)嚴(yán)重異構(gòu)為其他形式的CLNA，而堿性催化的方法進(jìn)行甲酯化，55℃反應(yīng)20 min既能使甲酯化完全，且石榴酸等CLNA保持穩(wěn)定，一般認(rèn)為堿性催化法比酸性催化法提供更加穩(wěn)定的反應(yīng)條件［10］，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。研究表明對于O－酰基脂質(zhì)來說，堿性催化法優(yōu)于酸性催化法，這與Igarashi等［11］采用不同甲酯化方法對α－桐酸進(jìn)行甲酯化比較的研究結(jié)果以及 Park等［4，6］采用不同甲酯化方法對CLA比較的結(jié)果相一致。綜合硫酸甲醇催化、BF3－CH3OH催化法甲酯化和甲醇鈉堿法催化甲酯化的試驗(yàn)結(jié)果，CLNA由于結(jié)構(gòu)的特殊性，含CLNA的三酰甘油不適宜采取酸法進(jìn)行，酸法甲酯化需要在高溫下長時(shí)間反應(yīng)，這導(dǎo)致CLNA構(gòu)型異構(gòu)和氧化，并產(chǎn)生雜質(zhì)，影響GC分析而不能精確定量分析CLNA的含量和組成。而甲醇鈉堿法催化甲酯化能使三酰甘油和復(fù)雜脂質(zhì)在相對低的溫度和短的時(shí)間內(nèi)完全甲酯化，且對CLNA的構(gòu)型和含量影響較小，適宜作為自由脂肪酸含量低的脂質(zhì)的甲酯化方法。

表4 兩步法催化與堿催化甲酯化時(shí)栝樓籽油脂肪酸組成(n=2)

但是，堿性催化法不能催化自由脂肪酸的甲酯化，不能應(yīng)用于自由脂肪酸的甲酯化。對于易于酯化的自由脂肪酸來說，在溫和的反應(yīng)條件(50℃，10 min)對CLA和CLNA的影響較小，可以作為甲酯化的方法［12］。因此，對自由脂肪酸含量較高的復(fù)雜脂質(zhì)可以采取兩步來進(jìn)行:首先把復(fù)雜脂質(zhì)皂化裂解為自由脂肪酸，然后采用1 mol/L硫酸甲醇溶液50℃反應(yīng)10 min進(jìn)行甲酯化。結(jié)果表明，采取兩步法CLNA含量保持穩(wěn)定，且不產(chǎn)生雜質(zhì)，可以作為自由脂肪酸含量高的脂質(zhì)甲酯化方法。

綜上所述，對不同的含有CLNA的脂類樣本通過GC進(jìn)行定量分析時(shí)，應(yīng)該根據(jù)CLNA的化學(xué)形式選擇合適的甲酯化方法。對于自由脂肪酸含量低的脂質(zhì)的甲酯化方法直接采用堿性催化的方法(0.5 mol/L甲醇鈉甲醇溶液55℃反應(yīng)20 min)進(jìn)行甲酯化，而對自由脂肪酸含量高的復(fù)雜脂質(zhì)可以采用先以0.3 mol/L氫氧化鉀90%乙醇溶液37℃皂化裂解2 h，再采用酸性催化的方法(1 mol/L硫酸甲醇溶液50℃反應(yīng)10 min)進(jìn)行甲酯化。

［1］姜偉，萬梓龍，劉發(fā)義.甲醇鉀催化共軛化反應(yīng)合成共軛亞油酸甲酯的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2009，3:89－91

［2］Nuernberg K，Dannenberger D，Ender K，et al.Comparison of different methylation methods for the analysis of conjugated linoleic acid isomers by silver ion HPLC in beef lipids［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2007，55:598 －602

［3］Yamasaki M，Kishihara K，Ikeda I，et al.A recommended esterification method for gas chromatographic measurement of conjugated linoleic acid［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，1999，76:933 －938

［4］Park Y，Albright KJ，Cai ZY，et al.Comparison of methylation procedures for conjugated linoleic acid and artifact formation by commercial(trimethylsilyl)diazomethane［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49:1158 －1164

［5］Kramer JK，F(xiàn)ellner V，Dugan ME，et al.Evaluating acid and base catalysts in the methylation of milk and rumen fatty acids with special emphasis on conjugated dienes and total trans fatty acids［J］.Lipids，1997，32:1219 － 1228

［6］Park SJ，Park CW，Kim SJ，et al.Methylation methods for the quantitative analysis of conjugated linoleic acid(CLA)isomers in various lipid samples［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50:989 －996

［7］Czauderna M，Kowalczyk J，Korniluk K，et al.Improved saponification then mild base and acid－catalyzed methylation is a useful method for quantifying fatty acids，with special emphasis on conjugated dienes［J］.Acta Chromatographica，2007，18:59 －71

［8］Floch J，Lees M，Sloane Stanley GH.A simple method for the isolation and purification of total lipids form animal tissues［J］.Journal of Biological Chemistry，1957:497 － 509

［9］Igarashi M，Miyazawa T.Newly recognized cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on cultured human tumor cells［J］.Cancer Letters，2000，148:173 －179

［10］Christie WW.A simple procedure for rapid transmethylation of glycerolipids and cholesteryl esters［J］.Journal of Lipid Research，1982，23:1072 －1075

［11］Igarashi M，Tsuzuki T，Kambe T，et al.Recommended methods of fatty acid methylester preparation for conjugated dienes and trienes in food and biological samples［J］.Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2004，50:121 －128

［12］Aldai N，Murray BE，Najera AI，et al.Derivatization of fatty acids and its application for conjugated linoleic acid studies in ruminant meat lipids［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2005，85:1073 －1083.

Comparison of Different Methylation Methods for Analysis of Conjugated Linolenic Acid

Yuan Gaofeng1，2Chen Xiao'e Li Duo2
(School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean Univisity1，Zhoushan 316000)
(Department of Food Science and Nutrition，Zhejiang University2，Hangzhou 310029)

The lipids should be methylated before analysis of fatty acid in oils and biological samples by the gas chromatography.Different methods for methylation of conjugated linolenic acid(CLNA)in the two chemical forms，free fatty acid(FFA)and triacylglycerol(TAG)were compared by using the Trichosanthes kirilowii seed oil，which was rich in CLNA.The punicic acid(the predominant form of CLNA in Trichosanthes kirilowii seed oil)was seriously isomerized into other CLNA isomers when the Trichosanthes kirilowii seed oil(CLNA in the form of TAG)was methylated by using acid catalyst.However，the Trichosanthes kirilowii seed oil could be completely methylated by 0.5 mol/L NaOMe/methanol at 55 ℃ for 20 min without isomerization of CLNA.The results showed that precise methylation methods should be chosen according to the chemical forms of CLNA.For lipids with negligible FFA，it could be methylated by 0.5 mol/L NaOMe/methanol at 55 ℃ for 20 min.For lipids with considerable content of FFA，it could be methylated by the following two steps:First，the lipids were hydrolyzed into FFA by 0.3 mol/L KOH/90%ethanol at 37℃ for 2 h;second，the FFA was methylated by 1 mol/L H2SO4/methanol at 50℃ for 10 min.

conjugated linolenic acid，gas chromatography(GC)，methylation，acid catalyst，base catalyst

TS207.3

A

1003－0174(2011)10－0070－06

浙江海洋學(xué)院科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(21135010910)

2010－12－12

袁高峰，男，1978年出生，講師，博士，食品營養(yǎng)與安全