磷酸肌酸鈉對(duì)阿霉素所致心肌損傷的影響*

趙文英， 陳冬云， 齊 全

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,安徽 蕪湖 241000)

磷酸肌酸鈉對(duì)阿霉素所致心肌損傷的影響*

趙文英△， 陳冬云， 齊 全

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,安徽 蕪湖 241000)

目的： 探討磷酸肌酸鈉對(duì)阿霉素所致小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法60只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為磷酸肌酸鈉干預(yù)組、阿霉素組和正常對(duì)照組，觀察小鼠的一般情況，檢測(cè)血清中肌鈣蛋白I(TnI)、N端前腦鈉肽(NT-proBNP)及心肌組織中丙二醛(MDA)、ATP酶的變化，心肌細(xì)胞凋亡及心肌組織bcl-2、fas基因的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組及磷酸肌酸鈉組比較，阿霉素組心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的水腫變性，并可見部分細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)增大(Plt;0.05)；阿霉素組MDA明顯增高 (Plt;0.05)，ATP酶活力降低(Plt;0.05)；血清中TnI和NT-proBNP有增高的趨勢(shì)(Pgt;0.05)；磷酸肌酸鈉組與阿霉素組比較，bcl-2基因表達(dá)增多，fas基因表達(dá)減少(Plt;0.05)。結(jié)論磷酸肌酸鈉對(duì)阿霉素所致的心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與磷酸肌酸鈉減少氧自由基和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

磷酸肌酸鈉； 阿霉素； 細(xì)胞凋亡； 自由基

阿霉素(adriamycin，ADR)是一種廣譜高效蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，在臨床應(yīng)用廣泛。由于ADR與心肌組織的親和力明顯高于其它組織，具有嚴(yán)重的心臟毒性并具劑量依賴性，從而嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用[1]。長(zhǎng)期使用 ADR對(duì)心臟的慢性毒性作用主要是與累積劑量有關(guān)的擴(kuò)張性心肌病和充血性心力衰竭，常規(guī)藥物治療效果不理想，預(yù)后很差。其確切的病因機(jī)制尚未明確，有研究認(rèn)為，ADR導(dǎo)致心肌損傷與其半醌自由基介導(dǎo)的氧自由基損傷有關(guān)[2]。磷酸肌酸作為細(xì)胞內(nèi)的一種高能磷酸化合物，不僅可以在心肌細(xì)胞遭受缺血缺氧時(shí)為其提供能量，還可以保護(hù)心肌細(xì)胞膜免受氧自由基等有害物質(zhì)的侵襲[3]。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸肌酸可以透過細(xì)胞膜抑制膜通透性、改變孔道的開放以保護(hù)線粒體，減少細(xì)胞凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠作為研究對(duì)象，建立阿霉素心肌病動(dòng)物模型，予以磷酸肌酸鈉干預(yù)治療，為臨床有效治療阿霉素引起的心肌病提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物和試劑

健康6周齡雌性BALB/c小鼠60只，體重 (20±2)g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)為SCXK(蘇)2007-0001]。阿霉素由浙江海正藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)為20100423)，注射用磷酸肌酸鈉由吉林英聯(lián)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)為20091007)。ATP酶試劑盒及丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物工程研究所。小鼠心肌肌鈣蛋白(troponin I,TnI)、N端前腦鈉肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海研吉生物科技有限公司。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生研生物科技有限公司。

2動(dòng)物分組

健康6周齡雌性BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為3組(每組20只)：(1)正常對(duì)照組(contro1組)：每3 d尾靜脈注射生理鹽水(NS)10 mL/kg，共10次；(2)阿霉素組(ADR組)：每3d尾靜脈注射同容量的ADR 2 mg/kg，共10次,累積劑量20 mg/kg[5,6]；(3)磷酸肌酸鈉組(sodium phosphocreatine,CP組)：每3 d尾靜脈注射同容量的 ADR 2 mg/kg，共10次,累積劑量20 mg/kg，第6次時(shí)開始注射磷酸肌酸鈉200 mg·kg-1·d-1，共12 d。

3標(biāo)本收集

小鼠固定后，摘取眼球，取眶靜脈血，制備血清。采血后，迅速開胸取出心臟，取部分心臟用于免疫組化和bcl-2、fas基因表達(dá)檢測(cè)。

4觀察項(xiàng)目與方法

4.1癥狀及體征 觀察一般精神狀況，飲食，皮毛和體重情況等。

4.2小鼠血清TnI、NT-proBNP及心肌組織中ATP酶、MDA的測(cè)定 采血后，4℃，3 000 r/min 離心后取上清，用于檢測(cè)小鼠血清TnI和NT-proBNP的含量。摘除心臟后用生理鹽水沖洗干凈，稱取約0.5 g心肌組織置勻漿器中，在0 ℃條件下制備組織勻漿，離心后取上清用于檢測(cè)ATP酶活性及MDA含量，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

4.3組織病理學(xué)檢查 4％甲醛固定24 h的心肌組織用石蠟包埋，切成5 μm左右薄片，用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色。隨機(jī)選擇任意1張片的10個(gè)視野用彩色影像分析儀進(jìn)行分析。組織學(xué)病變以心肌纖維消失及胞漿空泡變性程度來判定 (計(jì)分0-3)。

4.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)按試劑盒說明書操作。(1)石蠟切片脫蠟至水化，PBS沖洗3 min×3次;(2)蛋白酶K消化15 min，PBS沖洗3 min×3次;(3)擦干組織周圍水分，滴加血清(羊抗) 5 min，甩干(以減少非特異性結(jié)合);(4) 滴加25-50 μL的TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次;(5)0.3％H2O2阻斷，37 ℃濕盒中孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；(6) 滴加DAB底物溶液，室溫5-10 min；蘇木素復(fù)染、脫水、封片。細(xì)胞核呈棕黃色為TUNEL反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)，光鏡下分析結(jié)果，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)即為細(xì)胞凋亡指數(shù)。

4.5半定量RT-PCR方法檢測(cè)bcl-2和fas基因的表達(dá) Trizol法提取心肌組織中的總RNA。利用RT-PCR kit(Carpentaria)合成 cDNA，設(shè)計(jì)GAPDH、bcl-2及fas基因相對(duì)應(yīng)的引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)后進(jìn)行 PCR(引物序列見表1)。PCR條件分別為GAPDH：預(yù)變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、 58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min；4 ℃保存。bcl-2：預(yù)變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min；4℃保存。fas：預(yù)變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 60 s、56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min；4 ℃保存。bcl-2、fas的PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳后溴乙啶染色，用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)分析并取得積分吸光度值，然后用同樣方法得出的GAPDH值來校正。

表1 bcl-2、 fas和GAPDH引物序列及RT-PCR產(chǎn)物大小

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1小鼠的一般狀況

正常對(duì)照組及CP組小鼠攝食、活動(dòng)、糞便等一般狀況良好，皮毛光滑；ADR組小鼠出現(xiàn)進(jìn)食明顯減少、活動(dòng)遲緩、豎毛。

2小鼠血清TnI、NT-proBNP含量及心肌組織MDA含量、ATP酶活性的變化

阿霉素組與正常組、磷酸肌酸鈉組比較MDA含量升高，ATP酶活性下降(Plt;0.05)，血清TnI和NT-proBNP的含量有升高的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)，見表2。

表2 小鼠TnI、NT-proBNP、MDA含量及ATP酶活性的變化

3心肌組織結(jié)構(gòu)的改變

HE染色后，正常對(duì)照組：心肌組織未見明顯變性； 阿霉素組：心肌組織的部分心肌細(xì)胞腫脹肥大明顯，細(xì)胞內(nèi)可見均勻的細(xì)小紅染顆粒，并伴有水樣變性(變性評(píng)分2-3分)，見表3；磷酸肌酸鈉組：心肌組織少部分心肌細(xì)胞腫脹肥大，細(xì)胞輕度水樣變性(變性評(píng)分1-2分),見表3、圖1。

4心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化

正常對(duì)照組：心肌組織未見明顯細(xì)胞凋亡改變，凋亡指數(shù)(16.23±6.11)％；阿霉素組：心肌組織中部分心肌細(xì)胞內(nèi)可見棕黃色顆粒、凋亡小體及碎片，凋亡指數(shù)(28.02±6.50)％；磷酸肌酸鈉組：心肌組織少部分心肌細(xì)胞內(nèi)可見棕黃色顆粒，凋亡指數(shù)(20.60±5.48)％；阿霉素組凋亡指數(shù)與正常對(duì)照組、磷酸肌酸鈉組比較差異顯著(Plt;0.05)，見表3、圖2。

表3 小鼠心肌組織細(xì)胞水腫分級(jí)及細(xì)胞凋亡指數(shù)

Figure 1.Histological changes of cardiac tissues in mice(HE staining,×400).A: contro1 group；B: ADR group；C: CP group.

Figure 2.Apoptosis were observed by TUNEL(×400).A: contro1 group；B: ADR group；C: CP group.Intracellular edema,nuclear degeneration and apoptotic bodies(black arrow) were observed in ADR group.There was no significant change in the control and CP group.

5小鼠心肌組織中的bcl-2、fas基因的表達(dá)變化

與正常組及磷酸肌酸鈉組比較，阿霉素組的bcl-2基因的表達(dá)降低(Plt;0.05)，fas基因表達(dá)升高(Plt;0.05);說明磷酸肌酸鈉可增加bcl-2基因表達(dá)，同時(shí)抑制fas基因表達(dá),見圖3。

Figure 3.The expression of bcl-2 and fas mRNA in mouse cardiac tissues was exzamined by RT-PCR.A,B:the electrophoretogram of RT-PCR; C,D:the homologous optical density scanning±s.n=20.*Plt;0.05 vs control group and CP group.M:marker;CON: control; ADR: adriamycin; CP: sodium phosphocreatine .

討 論

眾所周知，bcl-2基因是一有抑制細(xì)胞凋亡作用的基因，主要分布在線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞膜內(nèi)表面等處。Wu等[9]用ADR處理培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的bcl-2表達(dá)下降，與ADR的劑量有關(guān)。Fas蛋白是細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體家族。Nakamura等[10]在ADR大鼠心肌中證實(shí)，細(xì)胞凋亡由Fas途徑介導(dǎo)，抗Fas 的抗體能抑制ADR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而改善心功能。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)阿霉素可使心肌細(xì)胞bcl-2基因表達(dá)減少，fas基因表達(dá)增加；阿霉素組細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常對(duì)照組及磷酸肌酸鈉組升高，提示阿霉素引起的心肌細(xì)胞損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

磷酸肌酸鈉是人體內(nèi)自有的活性物質(zhì)，是人體重要的能量供應(yīng)源，為ATP補(bǔ)充能量，而 ATP是任何細(xì)胞代謝過程中最主要的能量源。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)磷酸肌酸鈉能顯著降低氧自由基的產(chǎn)生，并提高ATP酶的活力，減輕細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞內(nèi)鈣超載，使心肌細(xì)胞損傷減輕。Broeyer等[11]研究顯示阿霉素心肌病可引起心肌酶TnI及NT-proBNP水平升高，是反映心肌損傷嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)中用磷酸肌酸鈉干預(yù)組心肌細(xì)胞水腫不明顯，血清中肌鈣蛋白及前腦鈉肽較阿霉素組有下降趨勢(shì)，提示磷酸肌酸鈉可作為一種高效供能物質(zhì)對(duì)心肌細(xì)胞在代謝和功能上具有保護(hù)作用，減輕阿霉素引起的心肌損傷，改善心功能。

綜上所述，磷酸肌酸鈉對(duì)阿霉素心肌病的保護(hù)作用機(jī)制可能為：(1)進(jìn)入細(xì)胞參與高能磷酸肌酸水平的維持；(2)提供能量，減少氧自由基的產(chǎn)生及細(xì)胞內(nèi)鈣超載對(duì)細(xì)胞的損傷；(3)通過調(diào)節(jié)bcl-2及fas基因的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡。本研究為臨床預(yù)防和治療阿霉素心肌病提供理論依據(jù)，值得在臨床進(jìn)一步研究。

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多胺類對(duì)爪蟾屬蝌蚪癲癇模型的神經(jīng)保護(hù)作用

癲癇發(fā)作易損傷發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。內(nèi)源性的多胺(如腐胺、精脒和精胺)廣泛存在于CNS，與神經(jīng)性的細(xì)胞損傷有關(guān)，但其作用是減弱還是增強(qiáng)細(xì)胞損傷還不清楚。多胺類可作用于離子通道NMDA受體、鉀通道和鈣通道AMPA受體從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性。而神經(jīng)元活性可快速調(diào)節(jié)多胺的合成和降解。神經(jīng)元活性增強(qiáng)時(shí)，多胺合成的限速酶 - 鳥苷酸脫羧酶活性亦增強(qiáng)，從而導(dǎo)致多胺合成迅速增加。美國(guó)科學(xué)家用戊撐四唑(pentylenetetrazole，PTZ，一種驚厥劑)處理爪蟾屬蝌蚪癲癇發(fā)作模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PTZ首次處理后，第2次使用PTZ所致癲癇發(fā)作的起始時(shí)間比首次作用晚約4 h，這種保護(hù)作用是由于癲癇發(fā)作后腐胺(一種最簡(jiǎn)單的多胺)合成增多所致。腐胺不是通過直接調(diào)節(jié)離子通道，而是通過使神經(jīng)元由興奮變?yōu)橐种贫l(fā)揮作用。癲癇首次發(fā)作4 h后記錄頂蓋神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn) -氨基丁酸能(GABAergic)神經(jīng)元自發(fā)性的抑制性突觸后電位放電頻率增加。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腐胺通過一種非經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)化生成 -氨基丁酸(GABA)，GABA激活抑制性中間神經(jīng)元突觸前GABAB受體，GABAB受體的激活使抑制性神經(jīng)元代償性的上調(diào)GABA的釋放，從而產(chǎn)生這一效應(yīng)。當(dāng)腐胺和GABA的量恢復(fù)到正常水平時(shí)，抑制性的放電頻率仍處于高水平。若此時(shí)癲癇再次發(fā)作，動(dòng)物就會(huì)受到保護(hù)。目前尚不知癲癇發(fā)作后腐胺和(或)GABA是如何轉(zhuǎn)運(yùn)的?？傊?，癲癇發(fā)作時(shí)，多胺類對(duì)發(fā)育的大腦具有神經(jīng)保護(hù)作用。

Nat Neurosci,2011,14(4):505-512(朱小青)

Effectofsodiumphosphocreatineonadriamycin-inducedcardiotoxicity

ZHAO Wen-ying,CHEN Dong-yun,QI Quan

(DepartmentofMedicalOncology,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu241000,China.E-mail:zhaowy98@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the effect of sodium phosphocreatine on adriamycin-induced cardiotoxicity in mice.METHODSSixty female BALB/c mice weighing about 20 g were randomly divided into control group,adriamycin group and sodium phosphocreatine treatment group.The general conditions of the mice were observed.The content of amino-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP) and troponin I(TnI) in serum,the changes of malondialdehyde(MDA) concentration and ATPase activity in cardiac tissues were detected.The anti-apoptotic effect of sodium phosphocreatine was also evaluated byinsituterminal dUTP nick-end labeling (TUNEL).The mRNA levels ofbcl-2 andfaswere detected by RT-PCR.RESULTSThe intracellular edema,nuclear degeneration and apoptosis were observed in the cardiac tissues in adriamycin-treated mice.Compared with control group and sodium phosphocreatine treatment group,the apoptosis index was increased,the MDA concentrations were elevated and the activity of ATPase was decreased in mouse cardiac tissues in adriamycin group.The serum levels of TnI and NT-proBNP were increased,the expression ofbcl-2 was promoted and the expression offaswas inhibited in sodium phosphocreatine treatment group as compared to adriamycin group.CONCLUSIONSodium phosphocreatine protects mice from adriamycin-induced cardiotoxicity by reduction of oxygen free radicals and apoptosis in mouse cardiac tissues.

Sodium phosphocreatine; Adriamycin; Apoptosis; Free radicals

1000-4718(2011)05-0939-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.020

2010-12-23

2011-03-21

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.KJ2010B252)

△通訊作者Tel：0553-5711589;E-mail：zhaowy98@yahoo.com.cn