去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織CGRP及其1型受體的表達(dá)*

呂辰鵬， 楊 麗， 孫 影， 方 霽， 奉水旺， 粱 恒， 李淑琴， 張榮華△

(暨南大學(xué)1藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，2醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東 廣州 510632)

去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織CGRP及其1型受體的表達(dá)*

呂辰鵬1， 楊 麗1， 孫 影1， 方 霽2， 奉水旺1， 粱 恒2， 李淑琴1， 張榮華1△

(暨南大學(xué)1藥學(xué)院中藥學(xué)教研室，2醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察去卵巢骨質(zhì)疏松(OP)模型大鼠骨組織降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)及其1型受體(CGRPR1)的表達(dá)。方法將30只3月齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(15只)和模型組(15只)。采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)復(fù)制OP大鼠模型。去卵巢12周后，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)觀察各組大鼠股骨CGRP和CGRPR1 mRNA的表達(dá)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察各組大鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CGRP和CGRPR1蛋白的表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠股骨CGRP和CGRPR1 mRNA的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.01)；模型組大鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CGRP和CGRPR1蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.01)。結(jié)論骨組織CGRP及CGRPR1表達(dá)的減少可能是OP形成的機(jī)制之一。

降鈣素基因相關(guān)肽； 骨質(zhì)疏松； 卵巢切除術(shù)

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在脊椎動物的骨組織廣泛存在[1]，對骨代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用[2,3]。本實(shí)驗(yàn)通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織CGRP及CGRP1型受體(calcitonin gene-related peptide type 1 receptor,CGRPR1)表達(dá)的變化，探討CGRP在骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級(SPF)3月齡SD(Sprague-Dawley)雌性大鼠30只，體重(242.0±12.0)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK(粵)2008-0002。

1.2主要儀器 Prodigy型雙能X線骨密度儀(Lunar)，2-16K型臺式高速冷凍離心機(jī)(Sigma)，Veriti 96孔多重控溫梯度PCR儀(ABI)，GEL EQ凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，奧林巴斯顯微鏡(Olympus)，輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Shandon)。

1.3主要試劑 CGRP兔抗鼠多克隆抗體(Abcam)，CGRPR1兔抗鼠多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒(均購自武漢博士德生物工程有限公司)，ReverTra Dash RT-PCR Kit(Toyobo)等。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)動物分組及模型復(fù)制 30只3月齡SD雌性大鼠，隨機(jī)分為模型組(15只)和假手術(shù)組(15只)。模型組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)[4,5]，假手術(shù)組大鼠打開腹腔，找到卵巢，但不切除。

2.2標(biāo)本的制備 2組大鼠于手術(shù)12周后進(jìn)行雙能X線骨密度檢測，確定造模成功后處死。2％戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸，暴露心臟，心臟采血后，依次灌注200-250 mL生理鹽水和350-400 mL 4％多聚甲醛。灌注完畢后，迅速取左側(cè)股骨，用DEPC水處理后，包裹密封置液氮中保存，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。取出右側(cè)股骨，置4％多聚甲醛中4 ℃固定24 h。取出后置20％EDTA溶液中4 ℃脫鈣[6]，3 d換液1次，直至大頭針能順利刺入骨組織。常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，選擇遠(yuǎn)端干骺端切成4 μm厚的連續(xù)切片，貼片于防脫玻片，用于免疫組織化學(xué)染色。

2.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

① 總RNA的提取 采用Trizol一步法提取總RNA。

② 引物的設(shè)計(jì) 以管家基因G3PDH為內(nèi)參照。G3PDH引物由東洋紡(上海)生物科技有限公司提供，基因序列為：上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。CGRP和CGRPR1特異性引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[7,8]，由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，基因序列為：CGRP上游引物5′-AAGTTCTCCCCTTTCCTGGT-3′，下游引物5′-GGTGGGCACAAAGTTGTCCT-3′；CGRPR1上游引物5′-TGCTCTGTGAAGGCATTTAC-3′，下游引物5′-CAGAATTGCTTGAACCTCTC -3′。

③ 第一鏈cDNA的合成 反應(yīng)體系20 μL：RNase-free H2O 10 μL，random primer(25 μmol/L) 1 μL，Total RNA 1 μL，5×RT buffer 4 μL，dNTP mixture(10 mmol/L) 2 μL，RNase inhibitor(1×107U/L) 1 μL，ReverTra Ace 1 μL。反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃5 min，4 ℃ 5 min，1個循環(huán)。產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

④ PCR反應(yīng) 總反應(yīng)體系為100 μL：第一鏈cDNA 20 μL，RNase-free ddH2O 67 μL，10×PCR buffer 10 μL，序列特異性上游引物(10 μmol/L)1 μL，序列特異性下游引物(10 μmol/L)1 μL，KOD Dash 1 μL。G3PDH擴(kuò)增條件：98 ℃ 10 s，60 ℃ 2 s，74 ℃ 30 s，33個循環(huán)。CGRP擴(kuò)增條件：94 ℃ 10 s，52 ℃ 2 s，74 ℃ 30 s，33個循環(huán)。CGRPR1擴(kuò)增條件：94 ℃ 10 s，45 ℃ 2 s，74 ℃ 30 s，33個循環(huán)。

⑤ PCR產(chǎn)物分析 PCR反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)液10 μL進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照并對電泳條帶進(jìn)行分析。目的基因條帶灰度值與G3PDH條帶的灰度值之比作為目的基因mRNA 的表達(dá)水平參數(shù)。

2.4免疫組織化學(xué)染色

① 免疫組織化學(xué)染色步驟 切片常規(guī)烤片，脫蠟至水，進(jìn)行SABC染色。具體步驟如下：3％H2O2室溫孵育10 min；0.1％胰蛋白酶37 ℃修復(fù)抗原10 min；5％BSA室溫封閉20 min；滴加Ⅰ抗(CGRP：1∶200；CGRPR1：1∶50)4 ℃過夜；第2 d復(fù)溫至室溫，滴加Ⅱ抗工作液37 ℃孵育20 min；滴加SABC 37 ℃20 min；滴加DAB 顯色劑，顯微鏡下觀察控制反應(yīng)時間。以上步驟間均用0.2 mol/L PBS(pH=7.2)緩沖液洗滌5 min × 3次。蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。

② 陽性標(biāo)記的分析及數(shù)據(jù)的采集 每張切片均在光學(xué)顯微鏡下(×200)分析陽性標(biāo)記的分布情況，隨機(jī)選取5個視野觀察并拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Media Cybernetics)對表達(dá)結(jié)果進(jìn)行半定量分析[9]，測量免疫陽性部位的平均吸光度值(absorbance value,A)，并以mean density作為免疫反應(yīng)強(qiáng)度的參數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1總RNA的檢測

總RNA的1％瓊脂糖凝膠電泳條帶在紫外燈下觀察為3條帶,見圖1，分別為28 S、18 S、5 S，且各條帶清晰拖尾輕，說明其質(zhì)量和豐度均很高。在紫外分光光度計(jì)下檢測各組RNA的A260/A280值均介于1.8-2.0之間，說明其純度較高。

22組大鼠股骨CGRPmRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測表明，CGRP擴(kuò)增產(chǎn)物為370 bp,見圖2；2組CGRP目的基因條帶和G3PDH看家基因條帶灰度之比的結(jié)果見表1。從以上結(jié)果可以看出，模型組大鼠股骨CGRP mRNA的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.01)。

32組大鼠股骨CGRPR1mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測表明，CGRPR1擴(kuò)增產(chǎn)物為540 bp,見圖3；2組CGRPR1目的基因條帶和G3PDH看家基因條帶灰度之比的結(jié)果見表1。從以上結(jié)果可以看出，模型組大鼠股骨CGRPR1 mRNA的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.01)。

42組大鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CGRP的表達(dá)

CGRP的陽性標(biāo)記主要見于骨膜、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓區(qū)細(xì)胞和成骨細(xì)胞,見圖4；假手術(shù)組和模型組免疫陽性部位的平均吸光度見表2。由以上結(jié)果可以看出，模型組大鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CGRP的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.01)。

表1 CGRP和CGRPR1 mRNA的表達(dá)

Figure 3.The expression level of CGRPR1 mRNA in femur.1: marker; 2,4,6,8: G3PDH; 3,5: CGRPR1 of sham operation group; 7,9: CGRPR1 of model group.

Figure 4.Immunohistochemistry of CGRP in the metaphysis of distal femur(×200).A: sham operation group; B: model group.

52組大鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CGRPR1的表達(dá)

CGRPR1的免疫陽性反應(yīng)見圖5，假手術(shù)組和模型組免疫陽性部位的平均吸光度見表2。由以上結(jié)果可以看出，模型組大鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CGRPR1的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.01)。

表2 CGRP 和CGRPR1免疫陽性部位的平均吸光度值

Figure 5.Immunohistochemistry of CGRPR1 in the metaphysis of distal femur(×200).A: sham operation group; B: model group.

討 論

CGRP是一種含有37個氨基酸殘基的活性多肽。它由降鈣素基因編碼而成，在骨組織中主要分布于骨代謝活躍、成骨活性較高的區(qū)域，如干骺端、骨膜和髓腔，且骨骺的分布較骨干多。成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)自身也可自分泌或旁分泌CGRP[10]。

利用CGRP培養(yǎng)液培育SD大鼠頭蓋骨來源的OB，發(fā)現(xiàn)外源性CGRP可以促進(jìn)OB增殖而有利于骨形成[11]。研究還發(fā)現(xiàn)CGRP通過增強(qiáng)胰島素樣生長因子I的自分泌作用來間接地調(diào)節(jié)OB活性，從而發(fā)揮成骨效應(yīng)[12]。此外，CGRP可以明顯刺激體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的cAMP水平，通過cAMP/PKA信號途徑影響OB的代謝[13]。有研究也證實(shí)CGRP能夠抑制破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)的分化及活性[14,15]，通過給去卵巢大鼠外源性注射CGRP可抑制OC的骨吸收作用，但CGRP對OC骨吸收的抑制作用，可能是通過調(diào)節(jié)OB細(xì)胞因子的釋放而間接調(diào)節(jié)[3]?；趯B活性的促進(jìn)作用，CGRP能夠促進(jìn)骨形成[16]。Ballica等[17]用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使小鼠OB產(chǎn)生CGRP，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠的骨密度大幅增高，他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，即使切除卵巢后，轉(zhuǎn)基因鼠的骨密度也只是下降到與正常鼠相同的水平，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)骨密度的增加源于OB數(shù)量的增加、成骨速度的加快以及骨吸收的減少。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)12周后能夠形成OP，通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)OP模型大鼠股骨CGRP和CGRPR1 mRNA的表達(dá)顯著減少，免疫組織化學(xué)染色也表明OP模型大鼠股骨CGRP和CGRPR1蛋白的表達(dá)顯著減少。這一結(jié)果提示，大鼠骨組織CGRP及CGRPR1水平的降低與OP的形成存在著一定的聯(lián)系。CGRP及CGRPR1的減少可能導(dǎo)致其促進(jìn)骨形成功能的減弱，進(jìn)一步刺激OP的形成，這可能是OP形成的機(jī)制之一。但是，在OP形成過程中，是何種原因?qū)е麓笫蠊晒荂GRP及CGRPR1水平降低及CGRP具體通過哪種途徑來調(diào)節(jié)骨代謝，還需要進(jìn)一步的研究。

[1]Irie K,Hara-Irie F,Ozawa H,et al.Calcitonin gene-related peptide (CGRP)-containing nerve fibers in bone tissue and their involvement in bone remodeling[J].Microsc Res Tech,2002,58(2): 85-90.

[2]Bjurholm A,Kreicbergs A,Brodin E,et al.Substance P- and CGRP-immunoreactive nerves in bone[J].Peptides,1988,9(1): 165-171.

[3]Valentijn K,Gutow AP,Troiano N,et al.Effects of calcitonin gene-related peptide on bone turnover in ovariectomized rats[J].Bone,1997,21(3): 269-274.

[4]徐 進(jìn)，榮海欽，王 東，等.人甲狀胺激素相關(guān)蛋白(1-34)對去卵巢大鼠骨密質(zhì)和骨生物力學(xué)性能的影響[J].中國病理生理雜志，2007，23(6)：1233-1235.

[5]黎 波，張榮華.益骨膠囊對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織cbfα-mRNA表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志，2008，24(4)：759-762.

[6]Chang W,Tu C,Chen TH,et al.Expression and signal transduction of calcium-sensing receptors in cartilage and bone[J].Endocrinology,1999,140(12): 5883-5893.

[7]Eberhardt M,Neeb L,Vogel EM,et al.Glyceroltrinitrate facilitates stimulated CGRP release but not gene expression of CGRP or its receptor components in rat trigeminal ganglia[J].Neuropeptides,2009,43(6): 483-489.

[8]Dong YL,Vegiraju S,Chauhan M,et al.Expression of calcitonin gene-related peptide receptor components,calcitonin receptor-like receptor and receptor activity modifying protein 1,in the rat placenta during pregnancy and their cellular localization[J].Mol Hum Reprod,2003,9(8): 481-490.

[9]Franciso JS,Moraes HP,Dias EP.Evaluation of the Image-Pro Plus 4.5 software for automatic counting of labeled nuclei by PCNA immunohistochemistry[J].Braz Oral Res,2004,18(2): 100-104.

[10]Imai S,Matsusue Y.Neuronal regulation of bone metabolism and anabolism: calcitonin gene-related peptide-,substance P-,and tyrosine hydroxylase-containing nerves and the bone[J].Microsc Res Tech,2002,58(2): 61-69.

[11]廉 凱，杜靖遠(yuǎn)，張銀剛.降鈣素基因相關(guān)肽對大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化的影響[J].中國骨傷，2002，15 (1)：20-22.

[12]廉 凱，杜靖遠(yuǎn).降鈣素基因相關(guān)肽對鼠成骨細(xì)胞IGF-I及IGF-IR mRNA表達(dá)的影響[J].中國矯形外科雜志，2001，8(11)：1084-1087.

[13]Villa I,Mrak E,Rubinacci A,et al.CGRP inhibits osteoprotegerin production in human osteoblast-like cells via cAMP/PKA-dependent pathway[J].Am J Physiol Cell Physiol,2006,291(3): C529-C537.

[14]Ishizuka K,Hirukawa K,Nakamura H,et al.Inhibitory effect of CGRP on osteoclast formation by mouse bone marrow cells treated with isoproterenol[J].Neurosci Lett,2005,379(1): 47-51.

[15]徐 琳，譚潁徽，王建華，等.失神經(jīng)支配兔下頜骨骨折愈合過程中CGRP對OPG/RANKL表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，27 (10)：988-990.

[16]Huebner AK,Keller J,Catala-Lehnen P,et al.The role of calcitonin and α-calcitonin gene-related peptide in bone formation[J].Arch Biochem Biophys,2008,473(2): 210-217.

[17]Ballica R,Valentijn K,Khachatryan A,et al.Targeted expression of calcitonin gene-related peptide to osteoblasts increases bone density in mice[J].Bone Miner Res,1999,14(7): 1067-1074.

ExpressionofCGRPanditstype1receptorinbonetissuesofovariectomizedosteoporoticrats

Lü Chen-peng1,YANG Li1,SUN Ying1,FANG Ji2,FENG Shui-wang1,LIANG Heng2,LI Shu-qin1,ZHANG Rong-hua1

(1DepartmentofChineseMateriaMedica,PharmacyCollege,2DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzrh@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the expression levels of calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its type 1 receptor(CGRPR1) in bone tissues of ovarectomized osteoporotic rats.METHODSFemale SD rats of 3 month old were randomly divided into model group and sham operation group (15 rats in each group).The osteoporotic model was established by bilateral ovariectomy.Twelve weeks after ovariectomy,reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to detect the mRNA expression of CGRP and CGRPR1 in the femur.The protein expression of CGRP and CGRPR1 in the metaphysis of distal femur was determined by the technique of immunohistochemistry.RESULTSThe mRNA levels of CGRP and CGRPR1 in the femur in model group were significantly lower than those in sham operation group (Plt;0.01).The protein levels of CGRP and CGRPR1 in the metaphysis of distal femur in model group were significantly lower than those in sham operation group (Plt;0.01).CONCLUSIONThe decreased expression of CGRP and CGRPR1 in bone tissues may be one of the mechanisms in the pathogenesis of osteoporotic formation.

Calcitonin gene-related peptide; Osteoporosis; Ovariectomy

1000-4718(2011)05-0976-04

R361.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.027

2010-12-09

2011-03-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30772885)

△通訊作者 Tel：020-85228578; E-mail: tzrh@jnu.edu.cn