胎盤(pán)ABCB4表達(dá)下調(diào)對(duì)膽汁酸排泌功能的負(fù)性調(diào)節(jié)作用及其對(duì)圍生兒預(yù)后的影響

陳新萍, 張 智, 劉絲蓀

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西 南昌 330006)

胎盤(pán)ABCB4表達(dá)下調(diào)對(duì)膽汁酸排泌功能的負(fù)性調(diào)節(jié)作用及其對(duì)圍生兒預(yù)后的影響

陳新萍△, 張 智, 劉絲蓀

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西 南昌 330006)

目的： 研究妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)患者胎盤(pán)ABCB4表達(dá)下調(diào)對(duì)胎兒膽汁酸排泌代謝的影響及其與胎兒圍生期預(yù)后的關(guān)系。方法采用RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)妊娠晚期ICP患者(30例，ICP組)和正常晚孕婦女(30例，對(duì)照組)胎盤(pán)組織中ABCB4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，采用化學(xué)氧化法和酶動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)母血膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶，采用放射免疫分析方法檢測(cè)母血及臍血中的甘氨膽酸(GA)含量，并與胎兒圍生期預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果對(duì)照組胎兒圍生期預(yù)后明顯好于ICP組，其新生兒體重和Apgar評(píng)分均高于ICP組(Plt;0.01)，而羊水糞染率低于ICP組(Plt;0.01)。兩組胎盤(pán)組織中均檢測(cè)到ABCB4 mRNA和蛋白的表達(dá)，但與對(duì)照組相比，ICP組胎盤(pán)組織ABCB4 mRNA和蛋白均明顯降低(Plt;0.01)。ICP組母血中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素以及母血、臍血中GA水平均高于對(duì)照組(Plt;0.01)，而且，臍血GA、母血GA水平與ABCB4 mRNA呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.627；r=-0.795，均Plt;0.01)。結(jié)論胎盤(pán)ABCB4表達(dá)下調(diào)對(duì)胎盤(pán)膽汁酸的排泌功能有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這可能是引起ICP圍生兒預(yù)后不良的重要機(jī)制之一。

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥； 胎盤(pán)； 甘氨膽酸； ABCB4

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一種發(fā)生在妊娠中、晚期的常見(jiàn)病。ICP對(duì)母體無(wú)嚴(yán)重危害，但為胎兒窘迫、早產(chǎn)、羊水糞染、死胎和死產(chǎn)的主要原因之一[1,2]。ICP病因及發(fā)病機(jī)制研究多集中在母體方面：認(rèn)為ICP的發(fā)生與母體肝臟膽淤相關(guān)基因如ABCB4基因(P-glycoprotein gene)的異常表達(dá)有密切關(guān)系，但有關(guān)膽淤相關(guān)基因在胎盤(pán)組織的研究較少。鑒于ICP對(duì)母體影響甚微而對(duì)胎兒危害嚴(yán)重的特點(diǎn)以及肝細(xì)胞與胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能方面的相似性，我們從胎兒和胎盤(pán)組織膽汁酸代謝的角度，研究ICP患者胎盤(pán)組織ABCB4表達(dá)對(duì)胎兒膽汁酸代謝的影響及其對(duì)胎兒的危害。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

2008年9月至2009年6月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院的剖宮產(chǎn)病例60例。對(duì)照組30例：正常足月分娩妊娠婦女，平素月經(jīng)規(guī)則，末次月經(jīng)確切，年齡在20-38歲，均為單胎，無(wú)高血壓、糖尿病、心臟病和肝腎疾病史，無(wú)其它妊娠合并癥和并發(fā)癥；ICP組30例：按2008年《中華婦產(chǎn)科學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為ICP[1]，年齡為22-36歲，均于孕34-39周行剖宮產(chǎn)終止妊娠，孕前3個(gè)月或孕期服用過(guò)避孕藥或其它藥物、妊娠期有急慢性全身疾病、肝膽病史或自身免疫性疾病、有其它妊娠并發(fā)癥及合并癥或不能用ICP解釋的血、尿生化異常不納入本組實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

2方法

2.1標(biāo)本收集 兩組孕婦胎盤(pán)娩出后，從母面中央取材，取胎盤(pán)組織塊約1 cm×1 cm×1 cm，10％甲醛固定，另取一部分置液氮保存。按常規(guī)方法測(cè)量新生兒身長(zhǎng)、體重，準(zhǔn)確稱量胎盤(pán)重量和新生兒Apgar評(píng)分。根據(jù)羊水性狀分為0°-Ⅲ°,0°羊水清;Ⅰ°呈淡黃色;Ⅱ°呈黃綠色;Ⅲ°呈棕黃色黏稠。Ⅰ°改變?yōu)檩p度污染，Ⅱ°-Ⅲ°為重度污染。血標(biāo)本收集：(1)母體外周血：剖宮產(chǎn)術(shù)前在無(wú)菌條件下抽取對(duì)照組及ICP組孕婦空腹肘靜脈血各2管(3 mL/管)，一管送同位素室，置于2-8℃低溫冰箱保存統(tǒng)一待測(cè)；一管肝素抗凝送生化室進(jìn)行丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)及總膽紅素(total bilirubin,TBIL)的測(cè)定；(2)臍血標(biāo)本采集：新生兒斷臍后，采集臍靜脈血2 mL置于干燥管，送同位素室，置于2-8 ℃低溫冰箱保存待測(cè)。

2.2孕婦肘靜脈血與胎兒臍靜脈血甘氨膽酸(glycocholic acid， GA)測(cè)定及孕婦肝功能測(cè)定 采用競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫分析法、酶動(dòng)力學(xué)方法及化學(xué)氧化法檢測(cè)孕婦肘靜脈血與胎兒臍靜脈血GA和孕婦肝功能。GC-911 γ放射免疫計(jì)數(shù)儀由中國(guó)科大創(chuàng)新股份有限公司制造，試劑盒由北京中科院提供，實(shí)驗(yàn)按試劑盒提供的步驟進(jìn)行。參考正常值：空腹血清GA含量為(1.14±0.57)mg/L；空腹ALT:lt;40U/L；TBIL：1.71-17.10 mmol/L。

2.3胎盤(pán)組織ABCB4 mRNA測(cè)定 RT-PCR法行胎盤(pán)組織ABCB4 mRNA測(cè)定。在無(wú)菌試管內(nèi)將-80 ℃冷凍的胎盤(pán)組織用生理鹽水洗滌至無(wú)血色，剪刀將其剪碎后放入勻漿器內(nèi)攆成勻漿提取總RNA?？俁NA提取試劑 Biozol和BioRT逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(RT-PCR)試劑盒均購(gòu)自杭州博日科技有限公司。ABCB4片段長(zhǎng)度312 bp，RT-PCR擴(kuò)增上游引物5’- CTGCTGGAAAGATTGCAACAG-3’，下游引物5’-GAG CAA ATG AAC TCG CAT GTC-3’；內(nèi)參照β-actin 長(zhǎng)度521 bp，上游引物5’-CAC ACT GTG CCC ATC TAC GA-3’，下游引物5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mixture 0.5 μL，10×PCR buffer 0.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，Taq mix DNA polymerase 2.5 μL，cDNA18 μL加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物常規(guī)行瓊脂糖凝膠電泳，采用面積吸光度值半定量分析測(cè)定胎盤(pán)組織中ABCB4 mRNA灰度值，與相應(yīng)的β-actin灰度值相比，得出ABCB4 mRNA相對(duì)量。

2.4ABCB4蛋白在胎盤(pán)組織的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胎盤(pán)組織ABCB4蛋白表達(dá)。3-4 mm胎盤(pán)組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)于微波爐(高火煮沸6 min，中火20 min)修復(fù)抗原后，組織切片自然晾至室溫。3％H2O2室溫孵育10 min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS洗3次，5 min/次。抗ABCB4單抗(1∶10稀釋，艾碧康生物制品有限公司)孵育2 h。PBS洗 3次，5 min/次。中杉金橋Ⅱ抗室溫孵育30 min。PBS洗3次，5 min/次。DAB顯色10 min。蘇木素復(fù)染后，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，觀察結(jié)果。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

12組一般情況和圍生兒預(yù)后比較

ICP組與對(duì)照組孕婦平均年齡、孕次及產(chǎn)次無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)，孕周差異顯著(Plt;0.01)，兩組母血ALT及ABIL顯著差異(Plt;0.01)。對(duì)照組新生兒體重和Apgar評(píng)分均高于ICP組，差異顯著(Plt;0.01)；對(duì)照組胎盤(pán)重量高于ICP組，差異顯著(Plt;0.05)；ICP組羊水糞染率高于對(duì)照組，差異顯著(Plt;0.01),見(jiàn)表1。

表1 ICP組與對(duì)照組孕婦一般情況、新生兒體重、Apgar評(píng)分、胎盤(pán)重量和羊水糞染的比較

2母血、臍血GA水平比較

ICP組母血血清GA為(26.86±8.51)mg/L，與對(duì)照組[(2.70±2.19)mg/L]相比差異顯著(Plt;0.01)。ICP組中臍血GA(19.97±8.80)mg/L,與對(duì)照組[(5.83±5.06)mg/L]相比顯著差異(Plt;0.01)，ICP組母血與臍血血清GA水平呈顯著正相關(guān)(r=0.588，Plt;0.01)，但對(duì)照組母血與臍血血清GA水平無(wú)相關(guān)關(guān)系(r=0.212，Pgt;0.05),見(jiàn)表2。

表2 ICP患者和正常孕婦母血、臍血GA相關(guān)性分析

3胎盤(pán)組織ABCB4mRNA和ABCB4蛋白的表達(dá)

在ICP組及正常晚孕組胎盤(pán)組織中均檢測(cè)到ABCB 4 mRNA，見(jiàn)圖1，與正常妊娠組相比，ICP組胎盤(pán)組織中ABCB4 mRNA的水平下降(Plt;0.01),而且，ABCB4 mRNA相對(duì)量與臍血GA和母血GA均呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.627(Plt;0.01)和r=-0.795(Plt;0.01)，見(jiàn)表3。免疫組化顯示ABCB4蛋白在ICP胎盤(pán)中的定位和正常胎盤(pán)組織中分布基本一致，均分布于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，但是在正常妊娠胎盤(pán)組織中棕黃色顆粒顏色深,ICP胎盤(pán)組織棕黃色顆粒顏色較淺,見(jiàn)圖2。

Figure 1.RT-PCR analysis of ABCB4(312 bp) and β-actin(521 bp) mRNA expression.Lane 1,2: ICP group；Lane 3,4:control group.

表3 兩組胎盤(pán)ABCB4 mRNA相對(duì)量與母血、臍血GA相關(guān)性分析

Figure 2.Expression of ABCB4 protein in placenta tissues(immunohistochemical staining,×400).A:control group;B:ICP group.

討 論

母胎間膽汁酸經(jīng)胎盤(pán)的轉(zhuǎn)運(yùn)是妊娠期胎兒膽汁酸代謝的關(guān)鍵，胎兒血中膽汁酸必須首先通過(guò)載體蛋白經(jīng)合體滋養(yǎng)細(xì)胞基底膜攝入合體滋養(yǎng)細(xì)胞，再通過(guò)滋養(yǎng)細(xì)胞母體側(cè)依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入母體血液。生理妊娠情況下，胎兒膽汁酸水平高于母血中的水平，母胎間的膽汁酸濃度差有利于胎兒膽汁酸通過(guò)胎盤(pán)由母體排泄，使母胎膽汁酸處于動(dòng)態(tài)平衡[3]。ICP時(shí)，由于母體膽汁淤積，母體肝細(xì)胞內(nèi)的膽汁酸蓄積并逆流入體循環(huán)，母血膽汁酸水平升高，使得母胎間的膽汁酸濃度梯度不存在，胎盤(pán)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能同時(shí)受到損害，導(dǎo)致胎兒膽汁酸淤積[4]。本研究結(jié)果表明ICP組母血及臍血膽汁酸水平均明顯升高，且呈正相關(guān)，佐證了胎盤(pán)膽汁酸排泌功能受損可加重母胎高膽汁酸血癥對(duì)胎兒的危害[9]。

胎盤(pán)對(duì)膽汁酸的排泌與ABCB4蛋白有密切關(guān)系[5]。ABCB4蛋白是一種重要的載體蛋白，其基因定位于染色體7q21.1[6]，編碼產(chǎn)物即ABCB4蛋白，又名多藥耐藥蛋白，屬于p型糖蛋白(P-gp)超基因家族，其主要分布于肝臟毛細(xì)膽管膜，是肝臟毛細(xì)膽管膜磷脂輸出泵，能有效地轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂進(jìn)入毛細(xì)膽管，在毛細(xì)膽管內(nèi)膽鹽與磷脂可形成微膠粒，從而保護(hù)膽管細(xì)胞免受膽鹽損傷。肝細(xì)胞具有膜極性，由生化結(jié)構(gòu)和生物功能均不同的基底膜(血竇面)和毛細(xì)膽管膜(肝內(nèi)膽管面)組成，而胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞也和肝細(xì)胞有著相似的結(jié)構(gòu)，基底膜(胎兒面)和游離緣(母體面)質(zhì)膜，并且同樣存在著相應(yīng)的載體蛋白[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)影響膽汁酸代謝的ABCB4基因在胎盤(pán)組織中有著一定的表達(dá)。與正常組相比，ICP組ABCB4蛋白和mRNA較正常晚孕組的表達(dá)明顯下降，并且ABCB4 mRNA與臍血和母血甘膽酸呈負(fù)相關(guān)性，ABCB4蛋白在胎盤(pán)的作用可能類似于毛細(xì)膽管上的ABCB4蛋白，對(duì)維持胎盤(pán)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和排毒功能可能起著必要性的作用，而ICP胎盤(pán)ABCB4蛋白表達(dá)下降可能影響胎盤(pán)排泌功能。因此，我們認(rèn)為：ICP時(shí)，胎盤(pán)組織中ABCB4 mRNA 及ABCB4蛋白水平下降，也即胎盤(pán)母面的磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少，導(dǎo)致胎兒膽汁酸由胎盤(pán)排泌至母體血循環(huán)減少，引起胎兒體內(nèi)膽汁酸蓄積。

ICP時(shí)，ABCB4 mRNA及ABCB4蛋白表達(dá)減少，使得胎盤(pán)從胎兒至母體方向排泌膽汁酸的效率下降，導(dǎo)致ICP胎兒血清膽汁酸明顯升高可以導(dǎo)致胎兒窘迫、早產(chǎn)、羊水糞染、死胎及死產(chǎn)等嚴(yán)重后果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在ICP組，圍生兒胎兒窘迫發(fā)生率、羊水糞染發(fā)生率、早產(chǎn)的發(fā)生率均明顯高于對(duì)照組，進(jìn)一步驗(yàn)證了ICP時(shí)胎盤(pán)膽汁酸排泌功能受損可能是造成ICP胎兒預(yù)后不良的重要環(huán)節(jié)，而ICP胎盤(pán)排泌功能受損導(dǎo)致胎盤(pán)胎兒至母體方向膽汁酸濃度逆轉(zhuǎn)、胎兒循環(huán)膽汁酸水平增高是其主要機(jī)制之一[8]。Sepulveda等[9]的研究發(fā)現(xiàn)高濃度膽汁酸有濃度依賴性血管收縮作用，可使人離體胎盤(pán)絨毛表面血管痙攣，絨毛靜脈阻力增加，推測(cè)可能導(dǎo)致胎兒血流灌注急劇下降，胎兒急性缺氧。Altshuler[10]等認(rèn)為，由于膽汁酸是胎糞的主要成分，羊水胎糞污染時(shí)，羊水膽汁酸水平明顯升高，使得ICP胎盤(pán)絨毛板靜脈腔內(nèi)(胎兒循環(huán))外(羊水)均暴露于高濃度的膽汁酸中，致絨毛板靜脈血管收縮，可能導(dǎo)致胎兒急性缺氧。大量的藥理學(xué)和毒理學(xué)基礎(chǔ)研究表明[11]，膽汁酸對(duì)動(dòng)物和細(xì)胞具有明顯的毒理作用。口服大劑量膽汁酸可使動(dòng)物迅速死亡，而長(zhǎng)期較高濃度膽汁酸則有心臟功能抑制、血壓降低、免疫功能抑制和致癌等慢性毒性作用[12]。Bristes等[13]對(duì)因ICP 而死產(chǎn)新生兒的心肝腎組織進(jìn)行病理檢查,發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎曲小管上皮細(xì)胞均呈空泡變性,肺泡腔充滿棕黃色顆粒,腎小管管腔內(nèi)可見(jiàn)淡黃色均質(zhì)管型。目前還有研究認(rèn)為[14]ICP時(shí)，孕婦血中膽汁酸及膽紅素升高,高濃度的膽汁酸、膽紅素通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi),通過(guò)其細(xì)胞毒作用破壞線粒體膜,產(chǎn)生氧自由基,直接損害胎兒細(xì)胞及組織，出現(xiàn)呼吸功能障礙和胎兒對(duì)氧的利用障礙,加上胎盤(pán)絨毛間腔縮小,血流量減少及血液流變學(xué)異常等,使胎兒的儲(chǔ)備力下降,易造成胎兒窘迫、死產(chǎn)、死胎及早產(chǎn)等。至于ICP組羊水糞染發(fā)生率的增高原因則可能與胎兒窘迫有直接關(guān)系。胎兒窘迫時(shí)，機(jī)體重新分布血流，血液主要分布于腦、心臟、腎上腺等重要器官，腸道和皮膚血流量減少，腸道缺血導(dǎo)致痙攣，肛門(mén)括約肌松弛使得大量胎糞排出，導(dǎo)致羊水糞染。

本實(shí)驗(yàn)還提示ICP組圍生兒早產(chǎn)發(fā)生率高于對(duì)照組，這可能與 ICP組胎兒臍血中膽汁酸濃度明顯增高有關(guān)。Germain等[14]通過(guò)對(duì)人子宮肌纖維的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膽汁酸與子宮肌細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，縮宮素受體表達(dá)增加。因此，ICP患者的子宮肌纖維對(duì)縮宮素的敏感性增加，使早產(chǎn)的發(fā)生率增高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還表明，膽汁酸濃度增高可刺激胎膜、子宮內(nèi)膜釋放前列腺素誘導(dǎo)早產(chǎn)。另外，隨著人們對(duì)ICP對(duì)圍生兒影響的認(rèn)識(shí)加深，醫(yī)源性的剖宮產(chǎn)也增加了ICP患者早產(chǎn)的發(fā)生率。

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Down-regulationofABCB4expressioninplacentainhibitsglycocholicacidevacuationinfetusandisrelatedwithpoorprognosis

CHEN Xin-ping,ZHANG Zhi,LIU Si-sun

(DepartmentofObstetricsandGynaecology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:chenxpdr@163.com)

AIM: To investigate the relationship between ABCB4 (ATP-binding cassette,sub-family B,member 4) expression in placenta and glycocholic acid (GA) evacuation in fetus for evaluating the prognosis of fetus from women with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP).METHODSNormal pregnant women (control group,n=30) and ICP women (ICP group,n=30) hospitalized in our department were selected.The expression of ABCB4 mRNA and protein in placenta was detected by RT-PCR and immunohistochemistry,respectively.The total bilirubin (TBIL) and alanine aminotransferase (ALT) levels in maternal blood and the GA levels in maternal or umbilical blood were measured by chemical oxidation method,enzyme kinetics method and radioimmunoassay,respectively.RESULTSThe expression of ABCB4 mRNA and protein in placenta of ICP patients was significantly lower than that of the controls (Plt;0.01).The TBIL and ALT levels in maternal blood and the GA levels in both maternal and umbilical blood of ICP women were higher than those of the controls (Plt;0.01).The GA levels in maternal and umbilical blood were negatively correlated with the ABCB4 mRNA levels in placenta (r=-0.627 andr=-0.795,respectively,Plt;0.01).In control group,the weight and Apgar scores of the newborns were higher than those in ICP group (Plt;0.01).However,the rate of stool contamination in amniotic fluid was lower in control group than that in ICP group (Plt;0.01).CONCLUSIONDown-regulation of ABCB4 expression is involved in the impairment of bile acid secretion in placenta and may be a marker for poor prognosis of the fetus from ICP women.

Intrahepatic cholestasis of pregnancy; Placenta; Glycocholic acid; ABCB4

1000-4718(2011)05-1012-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.035

2010-12-26

2011-03-24

△通訊作者 Tel:0791-8692551;E-mail:chenxpdr@163.com