絲瓜提取物抗氧化活性的研究*

潘永勤， 李 菁， 朱偉杰， 賀惠娟

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生殖免疫研究所，廣東 廣州 510632)

絲瓜提取物抗氧化活性的研究*

潘永勤1#， 李 菁1△， 朱偉杰2， 賀惠娟1#

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生殖免疫研究所，廣東 廣州 510632)

目的分離提取絲瓜抗氧化活性成分，觀察其抗氧化效應(yīng)。方法應(yīng)用溶劑萃取法及葡聚糖凝膠柱層析法分離提取絲瓜抗氧化活性物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定不同提取物的抗氧化能力，篩選出絲瓜的抗氧化活性成分。結(jié)果由溶劑萃取法獲得絲瓜提取物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，其中提取物Ⅲ抑制DPPH·和OH·自由基效果顯著。提取物Ⅲ經(jīng)柱層析進(jìn)一步分離，得到A、B、C、D、E 5種組分，其中組分D、E抑制DPPH·和OH·自由基效果最顯著，經(jīng)鑒定提取物符合黃酮類物質(zhì)特性。結(jié)論絲瓜具有清除自由基的作用，且主要作用物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)。

絲瓜； 抗氧化； 黃酮類； 自由基

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。人體及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示應(yīng)用降血脂、抗氧化藥物或食物補(bǔ)充劑可降低LDL水平、減輕LDL氧化修飾，從而延緩AS的發(fā)展[1-3]。

絲瓜(Luffacylindrica,LC)作為食用蔬菜在我國(guó)廣泛種植，并以絲瓜絡(luò)的形式應(yīng)用于中藥方劑中，具有清熱解毒之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示絲瓜具有抗真菌、抗艾滋病病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[4-6]。本課題組的前期工作揭示，絲瓜絡(luò)具有降血脂及減輕心肌缺血性損傷的作用，新鮮絲瓜亦有降血脂及抗氧化功效[7-10]，但具體的作用機(jī)制尚未清楚，絲瓜所含的抗氧化活性物質(zhì)很可能是其作用基礎(chǔ)。本項(xiàng)工作應(yīng)用溶劑萃取法和葡聚糖凝膠柱層析法分離提取絲瓜抗氧化活性成分，為絲瓜作為抗AS藥物開發(fā)應(yīng)用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1試劑

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydarzyl, DPPH·)購(gòu)自Sigma；維生素C (vitamine C，Vit C)購(gòu)自北京普博欣公司；OH·測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司。

2絲瓜活性成分的提取

新鮮絲瓜50 g，攪碎，用70%丙酮400 mL浸泡、攪拌4 h。超聲提取30 min，10 000×g離心10 min，收集上清。殘?jiān)僖?0%丙酮超聲提取30 min，重復(fù)2遍。合并上清液，減壓濃縮后用100 mL雙蒸水溶解得絲瓜初提液Ι。將初提液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相減壓濃縮，得石油醚相提取物Ⅱ，乙酸乙酯相提取物Ⅲ，正丁醇相提取物Ⅳ，水相提取物Ⅴ。

Sephadex LH-20 柱層析：0.6 g乙酸乙酯相提取物Ⅲ上樣，甲醇洗脫(0.5 mL/min)，每10 mL為一餾分，共收集30餾分。每一餾份取5 μL, 點(diǎn)樣于薄層硅膠預(yù)制板上，以氯仿-甲醇(9∶1)為展開劑，展開。晾干，碘顯色，根據(jù)薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)將洗脫餾份分為A、B、C、D、E 5個(gè)組份。

3DPPH自由基抑制作用的測(cè)定

DPPH·為穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有最大吸收。當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑存在時(shí)，DPPH·的單電子被配對(duì)而使其溶液顏色變淺，吸光度值變小，以吸光度的變化反映抗氧化劑活性[12]。提取物對(duì)DPPH·的抑制作用按文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行[13]。

4羥自由基(OH·)抑制作用的測(cè)定

利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基的原理進(jìn)行測(cè)定，規(guī)定每毫升樣品液在37 ℃下反應(yīng)1 min，使反應(yīng)體系中H2O2濃度降低1mmol/L為1個(gè)抑制羥自由基能力單位,測(cè)定步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行[14]。

5提取物的鑒定

利用1%三氯化鋁顯色反應(yīng)對(duì)絲瓜提取物進(jìn)行初步鑒定[15]。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1絲瓜提取物對(duì)DPPH·的抑制作用

絲瓜提取物Ι、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均對(duì)DPPH·有一定的抑制作用，其中提取物Ⅲ作用效果最顯著。當(dāng)Ⅲ濃度為1 g/L時(shí)，抑制率達(dá)100%，且在濃度范圍0.25～1g/L內(nèi)呈量效關(guān)系，見表1。

表1 絲瓜提取物抑制DPPH·能力的比較

2絲瓜提取物對(duì)OH·的清除作用

圖1 為絲瓜提取物抑制OH·能力的比較，抑制能力強(qiáng)弱為：Ⅴgt;Ιgt;Ⅲgt;Ⅳgt;Ⅱ。其中水相提取物Ⅴ對(duì)OH·的抑制能力為(262±22)×103U/L，顯著高于其余各相提取物(Plt;0.01)。

3SephadexLH-20柱層析

提取物Ⅲ經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱分離，得到5種產(chǎn)物，分別為提取物A、B、C、D、E，其中提取物D及E抑制DPPH·能力最強(qiáng)，且抑制效果比同劑量的Vit C顯著，見表2。

圖2 所示為5種提取物抑制OH·能力的比較，提取物E、D均有抑制效應(yīng)。提取物E對(duì)OH·的抑制能力最強(qiáng)，達(dá)(272±15)×103U/L，且強(qiáng)于1 g/L Vit C。

4絲瓜提取物E、D顯色反應(yīng)

絲瓜提取物E、D經(jīng)三氯化鋁顯色后呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，紫外燈下觀察可見強(qiáng)熒光，表明其為黃酮類物質(zhì)。

Figure 1. The inhibitory effect of different solvent extracts from Luffa cylindrica on OH·. Concentration of each extract was 5 g/L. Extract Ι: crude extract; extractⅡ: ligarine extract; extract Ⅲ:acetic ether extract; Extract Ⅳ:n-butanol extract; extract Ⅴ: water extract±s.n=3.**Plt;0.01 vs extract Ι;##Plt;0.01 vs extract Ⅲ.

表2 提取物Ⅲ分離后5種組分抑制DPPH·能力比較

Figure 2. The inhibitory effect of the five fractions of extract Ⅲ from Luffa cylindrica on OH·. Concentration of each fraction was 5 g/L.A:fraction A; B: fraction B; C: fraction C;D: fraction D; E: fraction E; Vit C: vitamin C±s.n=3.**Plt;0.01 vs Vit C ;##Plt;0.01 vs fraction D.

討 論

天然抗氧化物可有效地清除自由基，阻止脂蛋白發(fā)生氧化修飾，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而抑制AS發(fā)生發(fā)展，預(yù)防心腦血管疾病。因此，尋找降血脂、抗脂蛋白氧化修飾的藥物，尤其是天然抗氧化物對(duì)AS的防治有臨床應(yīng)用價(jià)值[16, 17]。

目前絲瓜或絲瓜絡(luò)發(fā)揮體內(nèi)外抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未清楚，從絲瓜獲取抗氧化有效成分是研究開發(fā)絲瓜抗AS藥物的基礎(chǔ)。我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)，絲瓜初提液中含有豐富的多酚[9]。多酚為天然抗氧化物，廣泛存在于各種植物中，目前研究較多的有蘋果多酚、茶多酚、花青素等。多酚具有抗炎、抑菌、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)活性，作用機(jī)制可能與其能夠清除機(jī)體內(nèi)過(guò)剩的自由基有關(guān)[19-22]?，F(xiàn)已證實(shí)植物中多酚含量與其抗氧化能力呈量效關(guān)系[18]。因此，絲瓜的抗氧化效應(yīng)亦可能是源于其所含的多酚類物質(zhì)。

通過(guò)測(cè)定及比較不同階段提取物抗氧化能力的差異，篩選抗氧化活性成分。絲瓜初提液Ι經(jīng)不同溶劑萃取后，得到提取物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 4種產(chǎn)物。除石油醚相提取物Ⅱ外，其余各相提取物均對(duì)DPPH· 具有較強(qiáng)的抑制能力，其中乙酸乙酯相提取物Ⅲ的作用效果最顯著。提取物Ⅴ及Ⅲ均對(duì)OH·具有較強(qiáng)的抑制作用，提取物Ⅴ為水相萃取物，其主要成分可能為Vit C,經(jīng)顯色反應(yīng)檢驗(yàn)，僅提取物Ⅲ符合黃酮類物質(zhì)特征。因此，選取乙酸乙酯相提取物Ⅲ作進(jìn)一步的分離。乙酸乙酯相提取物Ⅲ經(jīng)凝膠柱層析后得5種產(chǎn)物：提取物A、B、C、D、E。其中提取物D、E對(duì)DPPH· 和OH·具有較強(qiáng)的抑制作用，且經(jīng)顯色反應(yīng)可判定為黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)為多酚家族中的重要成員，同樣具有抗炎、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、減輕缺血再灌注損傷等作用，其作用機(jī)制與黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性密切相關(guān)。具有降血脂、抗氧化作用的大豆黃酮(soybeanisoflavone,SI)、茶多酚(teaployphone,TP)、桑色素(morine) 等黃酮類化合物為近年研究的熱點(diǎn)。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，絲瓜或絲瓜絡(luò)調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝、維持氧化還原穩(wěn)態(tài)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)很可能是黃酮類化合物。

綜上所述，從絲瓜中分離得到的黃酮類物質(zhì)可能是其發(fā)揮體內(nèi)抗氧化作用的主要物質(zhì)；絲瓜具有抗氧化效應(yīng)，作為藥物或食物補(bǔ)充劑開發(fā)利用并應(yīng)用于預(yù)防或延緩AS具有較好的應(yīng)用前景。今后的研究工作將進(jìn)一步分離純化絲瓜提取物D、E，以期獲得單體化合物并進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，為研究開發(fā)絲瓜天然抗氧化藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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AntioxidativeactivityofextractsfromLuffacylindrica

PAN Yong-qin1, LI Jing1, ZHU Wei-jie2, HE Hui-juan1

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,2InstituteofReproductiveImmunology,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tlijing62@126.com)

AIM: To isolate the active compounds ofLuffacylindricaand investigate their antioxidative activity.METHODSAntioxidants fromLuffacylindricawere isolated using solvent extraction and Sephadex column chromatography. Active compounds of the extracts were identified with the antioxidative activity assays.RESULTSWith solvent extracting procedure, four extracts (Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ) were obtained. Among these extracts, extract Ⅲ had significant antioxidative activity, which exerted a potent scavenging effect for both DPPH· and OH· assays. For further purification, extract Ⅲ was subject to Sephadex column and five fractions ( A, B, C, D and E ) were isolated. Fraction D and E showed good efficiency on scavenging DPPH· and OH·, and exhibited flavanoid characteristics.CONCLUSIONLuffacylindricaefficiently scavenges free radical species, and flavanoid exerts this action.

Luffacylindrica; Antioxidation; Flavones; Free radicals

1000-4718(2011)11-2086-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.008

2011-05-25

2011-09-09

廣東省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(No.粵中醫(yī)[2004]26號(hào))；國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金資助項(xiàng)目

△通訊作者 Tel:020-85220253;E-mail:tlijing62@126.com

# 現(xiàn)工作單位：廣東省水電二局醫(yī)院(潘永勤)；湖北中醫(yī)學(xué)院(賀惠娟)