CCK－8 對(duì)LPS 誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的影響*

李巧霞， 韓冬艷， 叢 斌△， 單保恩， 張敬各

(1 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊050017;2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊050011)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen－presenting cells，APCs)，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮極其重要的作用。正常情況下，機(jī)體內(nèi)大多數(shù)DCs 以非成熟狀態(tài)分布于外周組織和器官中，它們具有強(qiáng)大的抗原攝取能力，表達(dá)低水平主要組織相容性復(fù)合物II(major histocompability complex II，MHC II)分子和協(xié)同刺激分子，誘導(dǎo)T 細(xì)胞的能力較弱。一旦攝取抗原或接受某些因素刺激，DCs 逐漸發(fā)育成熟，細(xì)胞表面MHC 分子和協(xié)同刺激分子表達(dá)增高，通過向T 細(xì)胞提呈抗原、提供協(xié)同刺激信號(hào)和建立細(xì)胞因子微環(huán)境來激活初始T 細(xì)胞并誘導(dǎo)其向具有不同功能的亞群分化［1］。因此，DCs 的成熟狀態(tài)直接影響到T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的性狀。

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK－8)是一種典型的腦腸肽，通過細(xì)胞表面的CCK 受體(CCK－receptor，CCKR)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能。我們先前的系列研究表明CCK－8 能 夠 抑 制 脂 多 糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(interleukin－10，IL－10)的分泌;并能抑制活化的巨噬細(xì)胞表面分化群80(cluster of differentiation 80，CD80)和分化群86(cluster of differentiation 86，CD86)的表達(dá)，降低其抗原提呈時(shí)的協(xié)同刺激功能［2］。此外，CCK－8能夠調(diào)節(jié)LPS 誘導(dǎo)的B 細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子表達(dá)和細(xì)胞因子分泌［3］。我們的最新研究表明，DCs 表面也表達(dá)CCKR，但CCK－8 對(duì)DCs 是否具有調(diào)節(jié)作用目前尚無報(bào)道。因此，本研究擬觀察CCK－8 對(duì)LPS 誘導(dǎo)DCs 成熟過程中細(xì)胞表型和功能改變的影響，以期進(jìn)一步揭示CCK－8 的免疫調(diào)節(jié)作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

CCK－8、LPS 和FITC dextran 購自Sigma;重組鼠粒－ 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant mouse GM－CSF)購 自RD;mouse CD11c (N418)MicroBeads、mouse CD4(L3T4)MicroBeads 和MS 分選柱購自Miltenyi Biotec;FITC anti－mouse CD80、PE anti－mouse CD86 和PE anti－mouse MHC class II 購自BioLegend;小鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin－6，IL－6)和腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF－α)ELISA kit 購自北京晶美生物公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純。

2 動(dòng)物

健康無熱原C57BL/6 和BALB/c 小鼠，8 ～10 周齡，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，恒溫(23 ±2)℃，濕度45% ～65%，每天光照12 h。常規(guī)高壓滅菌飲食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證為704186。

3 小鼠骨髓來源DCs 的培養(yǎng)和純化

DCs 的培養(yǎng)參考Inaba 等［4］的方法，略作修改。無菌取C57BL/6 小鼠股骨和脛骨骨髓，制備單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，PBS 洗滌2 次后，用含15 μg/L GM－CSF 的RPMI－1640 完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于6 孔板，密度為(1 ～2)× 109cells/L、3 ～4 mL/well。第3 d，輕輕吸棄未貼壁細(xì)胞全量換液。第5 d，吸棄半量培養(yǎng)液，并補(bǔ)充該量。第6、7 d，收集懸浮和半貼壁細(xì)胞，加入mouse CD11c(N418)Micro Beads，采用Mini MACS 免疫磁珠分離系統(tǒng)分離純化DCs。

4 流式細(xì)胞分析檢測(cè)DCs 表型

收集純化DCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L，接種于24 孔板1 mL/well，分別進(jìn)行以下分組處理:對(duì)照組(補(bǔ)加與實(shí)驗(yàn)組等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液);LPS組(加入LPS 終濃度為1 mg/L);LPS + CCK－8 組(加入LPS 終濃度為1 mg/L，再加入不同濃度的CCK－8 終濃度分別為10－6、10－8、10－10mol/L)。37℃、5%CO2孵育24 h，收集細(xì)胞，用PBS 洗1 次，分別加入FITC－抗CD80、PE－抗CD86 或PE－抗MHC II 抗體，4 ℃、避光孵育30 min，生理鹽水洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每次實(shí)驗(yàn)用同型抗體作為對(duì)照。用平均熒光強(qiáng)度(mean channel fluorescence，MCF)表示CD80、CD86 和MHC II 蛋白表達(dá)量。

5 流式細(xì)胞分析檢測(cè)DCs 吞噬功能

純化DCs 按上述不同因素處理孵育24 h，收集細(xì)胞加入1 g/L FITC－dextran(40 kD)于37 ℃繼續(xù)孵育1 h，用PBS 洗2 次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC陽性細(xì)胞率。

6 ELISA 法檢測(cè)DCs 細(xì)胞因子表達(dá)

純化DCs 按上述不同因素處理24 h 后，收集培養(yǎng)上清，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠IL－1β、IL－6和TNF－α 的含量。操作流程如下:采用倍比稀釋法獲得IL－1β、IL－6 和TNF－α 標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)板中每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)培養(yǎng)上清100 μL，37 ℃孵育90 min;PBS 洗板4 次;每孔加100 μL 生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min;PBS 洗板4 次;每孔加入酶結(jié)合物工作液100 μL，37 ℃孵育30 min;PBS 洗板4 次;每孔加入100 μL 顯色液，37℃避光孵育10－15 min;每孔加入100 μL 終止液混勻后，立即在450 nm 波長處檢測(cè)A 值。用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL－1β、IL－6 和TNF－α 的含量。

7 MTT 法檢測(cè)T 細(xì)胞增殖反應(yīng)

無菌取BALB/c 小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后加入CD4(L3T4)MicroBeads，采用Mini MACS 免疫磁珠分離系統(tǒng)分離純化CD4+T 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L，以2 ×105cells/well CD4+T 細(xì)胞與上述不同因素處理的DCs 2 × 104cells/well(即CD4+T 細(xì)胞與DCs 比例為10∶1)共同接種于96 孔板中，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT 20 μL(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL/well，37 ℃振蕩10 min，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570 nm 波長光吸收A值。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間均數(shù)比較行單因素方差分析(ANOVA)，方差齊時(shí)用最小顯著差法(least significant difference，LSD)，方差不齊時(shí)用Dunnett T3 法作兩兩比較。

結(jié) 果

1 CCK－8 抑制LPS 誘導(dǎo)DCs 表面CD80、CD86和MHC II 表達(dá)

純化DCs 未加任何因素處理時(shí)細(xì)胞表面CD80、CD86 和MHC II 表達(dá)水平較低，LPS 刺激24 h 后，三者表達(dá)明顯升高(P ＜0.01);不同濃度CCK－8 與LPS 同時(shí)作用DCs 后，細(xì)胞表面CD80、CD86 和MHC II 表達(dá)明顯低于LPS 組(P ＜0.05，P ＜0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，提示CCK－8 可抑制LPS 誘導(dǎo)的DCs 表型成熟，見圖1。

Figure 1. CCK－8 inhibited the expression of CD80，CD86 and MHC II on DCs induced by LPS. ±s. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs LPS group.圖1 CCK－8 抑制LPS 誘導(dǎo)DCs 表面CD80、CD86 和MHC II 表達(dá)

2 CCK－8 對(duì)LPS 誘導(dǎo)DCs 吞噬功能的影響

分離純化的DCs 未加任何因素處理時(shí)處于未成熟狀態(tài)，具有較強(qiáng)的吞噬FITC－dextran 的能力，LPS刺激24h 后，DCs 的吞噬功能減弱(P ＜0.01)，不同濃度CCK－8 與LPS 同時(shí)作用后，DCs 的吞噬能力較LPS 組明顯增強(qiáng)(P ＜0.01)，并呈劑量依賴關(guān)系，提示CCK－8 可以抑制LPS 誘導(dǎo)DCs 成熟，提高DCs的抗原攝取能力，見圖2。

Figure 2. Effect of CCK－8 on FITC－dextran uptake by DCs stimulated by LPS. ±s. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs LPS group.圖2 CCK－8 對(duì)LPS 誘導(dǎo)DCs 吞噬功能的影響

3 CCK－8 抑制LPS 誘導(dǎo)DCs 分泌細(xì)胞因子

純化未成熟DCs 自發(fā)產(chǎn)生TNF－α、IL－6 和IL－1β 的量非常低，低于試劑盒檢測(cè)的下限。LPS 孵育24 h 后，DCs 培養(yǎng)上清中TNF－α、IL－6 和IL－1β 的含量明顯增多(P ＜0.01);不同濃度CCK－8與LPS 同時(shí)作用則顯著降低了上述細(xì)胞因子的水平(P ＜0.01)，并呈劑量依賴關(guān)系，提示CCK－8 可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)DCs 成熟，抑制其分泌細(xì)胞因子TNF－α、IL－6 和IL－1β，見圖3。

Figure 3. Effect of CCK－8 on cytokine production of DCs induced by LPS. ± s. n = 3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs LPS group.圖3 CCK－8 對(duì)LPS 誘導(dǎo)DCs 分泌細(xì)胞因子的影響

4 CCK－8 處理DCs 對(duì)同種異體T 細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

DCs 刺激同種異體小鼠脾T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的程度用A 值表示。未成熟DCs 刺激同種異體T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力較弱，經(jīng)LPS 誘導(dǎo)成熟的DCs 刺激同種異體T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力顯著增強(qiáng)(P ＜0.01)，CCK－8 與LPS 同時(shí)作用DCs 后，與LPS 組相比，DCs 刺激同種異體T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力明顯減弱，并呈劑量依賴效應(yīng)(P ＜0.05，P ＜0.01)，提示CCK－8 可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)DCs成熟，抑制其對(duì)T 淋巴細(xì)胞的協(xié)同刺激效應(yīng)和抗原提呈能力，見圖4。

Figure 4. Effect of CCK－8 treatment DCs on proliferation of allogenic T－lymphocytes. ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 ，△△P ＜0.01 vs LPS group.圖4 CCK－8 處理DCs 對(duì)同種異體T 淋巴細(xì)胞增殖的影響

討 論

DCs 廣泛分布于外周非淋巴組織(如皮膚、胃腸道和呼吸道)，參與機(jī)體抵抗外界病原體入侵的第一道防線，時(shí)刻監(jiān)視著機(jī)體環(huán)境中的各種外來因子，是針對(duì)包括細(xì)菌成分在內(nèi)的各種病原體引起免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)者，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮極其重要的作用［5，6］。臨床上，以DCs 為基礎(chǔ)的疫苗在癌癥患者中已被用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)［7］，而在器官移植和自身免疫性疾病中已被用于誘導(dǎo)免疫耐受［8］。因此，決定DCs 誘導(dǎo)免疫反應(yīng)還是誘導(dǎo)免疫耐受的因素已經(jīng)成為研究焦點(diǎn)。正常情況下，機(jī)體內(nèi)DCs 以非成熟狀態(tài)分布于外周組織和器官中，未成熟DCs 具有強(qiáng)大的攝取抗原的能力，它們表達(dá)低水平的MHC II 分子和協(xié)同刺激分子。已有研究證明這些未成熟的穩(wěn)定狀態(tài)的DCs 能夠通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的產(chǎn)生或去除免疫效應(yīng)T 細(xì)胞的活化來維持免疫耐受［9］。而成熟狀態(tài)的DCs 喪失了其抗原攝取能力，表達(dá)高水平的MHC II 分子和協(xié)同刺激分子，通過向T 細(xì)胞提呈抗原啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)［10］。在T 細(xì)胞極化的起始階段，DCs 通過向T細(xì)胞提呈抗原、提供協(xié)同刺激信號(hào)和建立細(xì)胞因子微環(huán)境來影響T 細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能。因此，DCs依其成熟狀態(tài)而調(diào)控免疫應(yīng)答，了解調(diào)控DCs 成熟與功能狀態(tài)的因素是防止不必要免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。

DCs 的成熟或激活主要通過兩條途徑［11］:(1)模式識(shí)別途徑:通過DCs 表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)來識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)而激活;(2)非模式識(shí)別途徑:通過對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境中自身分子和變化產(chǎn)生反應(yīng)而激活。DCs 上的PRR 包括:Toll 樣受體(Toll－like receptor，TLR)、C 型凝集素受體(C－type lectin receptor，CLR)、雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶(dsRNA－dependent protein kinase，PKR)等。LPS 是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分。已有研究證明，LPS 主要通過識(shí)別DCs 表面的TLR4 而激活DCs［12］，是體外實(shí)驗(yàn)用于激活DCs 的主要途徑。

本文研究結(jié)果表明，1 mg/L LPS 孵育DCs 24 h后，可誘導(dǎo)細(xì)胞表面MHC II、CD80、CD86 表達(dá)顯著增加，并且把LPS 誘導(dǎo)的DCs 作為APC 與同種異體CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，可顯著提高CD4+T 細(xì)胞的增殖能力。表明LPS 可促進(jìn)DCs 的表型和功能成熟，增強(qiáng)DCs 的協(xié)同刺激功能和抗原提呈能力，這些結(jié)果與文獻(xiàn)［13］報(bào)道一致:提示機(jī)體在細(xì)菌感染等因素作用下，樹突細(xì)胞的協(xié)同刺激活性及抗原呈遞能力增強(qiáng)，因此可能成為一些自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的誘發(fā)因素。當(dāng)在LPS 刺激DCs 的同時(shí)加入CCK－8 共同作用，CCK－8 可以劑量依賴性地下調(diào)LPS 誘導(dǎo)樹突細(xì)胞表面MHC II 和CD80、CD86 的表達(dá)，這與CCK－8 對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用相似［14］;且CCK－8 和LPS 共同孵育的DCs 作為APC 刺激同種異體CD4+T 細(xì)胞的增殖能力明顯下降，提示CCK－8 對(duì)LPS 誘導(dǎo)DCs成熟過程中的細(xì)胞表型和抗原提呈功能有抑制作用。此外，經(jīng)LPS 刺激后，DCs 大量分泌細(xì)胞因子IL－1β、IL－6 和TNF－α，這些細(xì)胞因子可以使DCs進(jìn)一步活化，二者形成正反饋;并且，這些細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞等的募集，從而導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生和加重。CCK－8 與LPS 同時(shí)作用DCs 后，可顯著抑制IL－1β、IL－6 和TNF－α的產(chǎn)生，這將有利于減緩炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。目前有研究表明，血管活性腸肽和垂體苷腺酸環(huán)化酶激活肽通過下調(diào)LPS 活化的樹突細(xì)胞協(xié)同刺激活性和抗原呈遞能力，從而緩解了膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［15］。結(jié)合本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示CCK－8可能通過對(duì)LPS 誘導(dǎo)DCs 成熟過程中細(xì)胞表型和功能的影響進(jìn)而在抗感染和相關(guān)炎癥性疾病中發(fā)揮作用。

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