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    清胰湯對L-精氨酸誘發(fā)的重癥急性胰腺炎小鼠胰腺p-STAT3 表達(dá)的影響*

    2011-12-23 04:07:18張曉芹賈曉云李保蘭史迎莉
    中國病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:胰湯淀粉酶活化

    張曉芹, 賈曉云, 李 濤, 李保蘭, 史迎莉, 張 紅△

    (1 陜西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室,陜西 咸陽712046;2 敦化市醫(yī)院病理科,吉林 敦化133700)

    重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種危重疾病,病死率可高達(dá)20% ~30%。近年來的研究提示:細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在SAP 發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1],尤其是白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)在輕癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎患者血清水平存在明顯差異,因此,IL -6 的血清水平已經(jīng)作為反映SAP 嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[2,3]。近來研究顯示IL-6 等細(xì)胞因子通過誘發(fā)其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的活化促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展[4]。而急性胰腺炎時STAT3 通路是否活化、抑制STAT3 活化是否可以有效減輕急性胰腺炎的炎癥損傷值得深入研究。

    腹腔內(nèi)注射大劑量L-精氨酸(L-arginine,LArg)是近年來開始使用的一種小鼠急性胰腺炎造膜方法,此法所誘導(dǎo)模型胰腺病變的程度在不同部位比較一致,與人類急性胰腺炎的病程及組織學(xué)改變相似,是研究急性胰腺炎及其防治措施的理想動物模型[5]。本課題采用20% L -Arg 復(fù)制小鼠急性胰腺炎模型,觀察急性壞死性胰腺炎模型胰腺STAT3活化程度的變化,及與SAP 進(jìn)展密切相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1[6](monocyte chemoattractant protein-1,MCP -1)的變化,并觀察清胰湯(Qingyi decoction,QYD)對急性壞死性胰腺炎小鼠胰腺STAT3 活性的影響及對胰腺、肺損傷的治療作用,從而探討STAT3 在急性胰腺炎中的作用和清胰湯治療SAP 的分子機(jī)制。為早期預(yù)測SAP 提供有臨床價值的指標(biāo),為清胰湯用于臨床治療急性胰腺炎提供理論依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 動物

    健康昆明小鼠(雄性)30 只,6 ~8 周齡,體重18~25 g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證書號0001442),各組小鼠分籠飼養(yǎng),術(shù)前12 h 禁食,不禁水,室溫飼養(yǎng)。

    2 藥品、試劑和儀器

    L-Arg 購于Sigma -Aldrich(A8094);清胰湯由柴胡15 g、黃芩10 g、黃連10 g、白芍15 g、木香10 g、芒硝10 g、生大黃15 g(后下)組成,加水煎煮濃縮成85 mL(1.0 kg 生藥/L),分裝后置4 ℃保存?zhèn)溆?。兔抗小鼠STAT3 單克隆抗體購于Santa Cruz(sc -21876 -R);HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購于博士德試劑公司(BA1054);兔抗小鼠β-actin 單克隆抗體購于博奧森公司(bs-0061R);ECL 發(fā)光試劑盒購于博士德試劑公司(AR1170);淀粉酶試劑盒購于南京建成生物研究所;RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量PCR 試劑為天根公司產(chǎn)品;其它為當(dāng)?shù)卦噭┕咎峁┑姆治黾兓瘜W(xué)試劑;酶標(biāo)儀(Bio-Tek ELX808IU);Western blotting 電泳轉(zhuǎn)膜及凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio -Rad);7300型熒光定量PCR 儀(ABI)。

    3 動物分組及造模

    健康雄性昆明小鼠30 只(6 ~8 周齡,體重18 ~25 g),隨機(jī)分為3 組(n=10):對照組(control);模型組(SAP);清胰湯組(SAP +QYD)。除對照組外,模型組和清胰湯治療組給予腹腔注射20% L -Arg[5](3 g/kg,間隔1 h 再注射1 次);清胰湯治療組在第2 次腹腔注射20% L -Arg 30 min 后給予清胰湯濃縮液灌胃(10 mL/kg),之后每天灌胃2 次。

    4 標(biāo)本采集與檢測

    造模后72 h 麻醉處死動物,經(jīng)下腔靜脈取血,分離血清;完整摘除胰腺、稱重,將一部分胰腺置于10%甲醛溶液浸泡固定,另一部分胰腺迅速置入液氮中,再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱,待提取蛋白行Western blotting 或提取RNA 行real - time PCR 檢測。開胸取左肺組織,于10%甲醛溶液浸泡固定,右肺迅速置入液氮中,再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱,待測髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性。

    4.1 胰腺和肺組織的病理學(xué)變化 一部分胰腺及左肺組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片,進(jìn)行HE 染色觀察胰腺及肺病理學(xué)改變。

    4.2 血清淀粉酶檢測 采用化學(xué)比色法檢測血清淀粉酶的活性。

    4.3 記算胰腺濕重比 胰腺濕重比= 胰腺重量(g)/體重(g)。

    4.4 肺組織MPO 檢測 取整個右肺,加緩沖液制成肺組織勻漿,10 000 r/min 4 ℃離心10 min,提取上清液,加入鄰聯(lián)茴香胺,雙氧水反應(yīng),分光光度計470 nm 波長下掃描,記錄第30 s 和第90 s 的吸光度差值,以評價肺組織中性粒細(xì)胞浸潤程度。

    4.5 Western blotting 檢測胰腺p -STAT3 的表達(dá)變化 取胰腺組織50 mg,加蛋白裂解液400 μL 勻漿,冰上放置30 min,10 000 r/min 4 ℃離心10 min,提取上清液,采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量后,用5 ×loading buffer 將樣品稀釋至4 g/L;以分子量18 ~94 kD 的marker 為參照,SDS - PAGE 膠蛋白電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,封閉液(5%脫脂奶粉)中緩慢搖蕩1 h ,用TBST 洗脫,滴加Ⅰ抗[分別為β - actin(1 ∶2 000);p-STAT3(1∶500)]至PVDF 膜,4 ℃搖床上孵育過夜。TBST 漂洗3 次,每次5 min。HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗(1∶1 000 稀釋),室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次,每次10 min。ECL 滴加于PVDF 膜上,在暗盒中將X 光片曝光,顯影、定影后,根據(jù)marker,進(jìn)行掃描。圖像經(jīng)GelDoc XR 軟件進(jìn)行吸光度值分析,并與內(nèi)參照β -actin 比較,以相對吸光度值代表蛋白表達(dá)量。

    4.6 實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測胰腺M(fèi)CP-1 mRNA 的表達(dá)變化 應(yīng)用PrimerExpress軟件(PE Biosystems)設(shè)計基因特異性PCR 引物序列,MCP-1 上游引物為5' -GTTGGCTCAGCCAGATGCA -3',下游引物5' - AGCGTACTCATTGGGATCATCTTG -3';β -actin 上游引物為5' -CATCCTGCGTCTGGACCT - 3',下游引物5' - TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'。按試劑的操作步驟提取胰腺組織中總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR,反應(yīng)條件(20 μL 體系):SYBR Green Mix 9 μL,cDNA(20 mg/L)4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,H2O 6 μL。擴(kuò)增條件:預(yù)熱50℃2 min,預(yù)變性95 ℃10 min,95 ℃15 s,60 ℃30 s,72 ℃30 s,共40 個循環(huán);以ΔCt 值表示目的基因MCP-1 相對表達(dá)量。

    5 統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 胰腺和肺組織的病理學(xué)變化

    如圖1 所示,對照組小鼠胰腺及肺組織光鏡下未見病變;SAP 72 h 組胰腺腺泡細(xì)胞腫脹,可見多處不同程度片狀壞死,間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤及出血。肺組織表現(xiàn)為肺泡間隔水腫、增寬,大量炎癥細(xì)胞浸潤;清胰湯治療組胰腺和肺組織病變明顯減輕,主要表現(xiàn)為胰腺腺泡輕度腫脹,間質(zhì)小血管擴(kuò)張、充血,有少量炎癥細(xì)胞浸潤。肺泡間隔輕度水腫、增寬,僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤。

    Figure 1. The effect of Qingyi decoction(QYD)on the pancreatic and lung morphology of mice with severe acute pancreatitis (ASP)at 72 h. A:control group;B:SAP group;C:SAP+QYD group.圖1 各組胰腺和肺組織的病理學(xué)變化

    2 血清淀粉酶活性變化

    如圖2 所示,SAP 誘發(fā)后,各組血清淀粉酶活性升高,與對照組相比較差異顯著(P <0.01);而清胰湯治療組淀粉酶的活性明顯降低,與SAP 組相比差異顯著(P <0.05)。

    Figure 2. The effect of QYD on the amylase activity in serum of mice with acute pancreatitis. ±s.n=10. △△P <0.01 vs control group;* P <0.05 vs SAP group.圖2 各組血清淀粉酶活性變化

    3 胰腺濕重比變化

    如圖3 所示,SAP 誘發(fā)后,胰腺濕重比增加,與對照組相比較,差異顯著(P <0.05);清胰湯治療組胰腺濕重比降低,與SAP 組相比,顯著差異(P <0.05)。

    Figure 3. The effect of QYD on the relative pancreatic weight of mice with acute pancreatitis. ±s.n=10. △P <0.05 vs control group;* P <0.05 vs SAP group.圖3 各組胰腺濕重比變化

    4 肺組織MPO 變化

    如圖4 所示,SAP 誘發(fā)后,肺組織勻漿MPO 水平明顯升高,與對照組相比,差異顯著(P <0.01);清胰湯治療組MPO 水平明顯降低,與SAP 組相比,差異顯著(P <0.01)。

    5 胰腺p-STAT3 的表達(dá)變化

    如圖5 所示,對照組小鼠胰腺未見p -STAT3 的活性表達(dá);SAP 組小鼠在胰腺炎誘發(fā)后72 h 胰腺p-STAT3 的活性表達(dá)明顯增強(qiáng);而清胰湯治療組72 h胰腺p-STAT3 的活性表達(dá)明顯少于SAP 組(n =3,P <0.01)。

    6 胰腺組織MCP-1 mRNA 的表達(dá)變化

    如圖6 所示,SAP 誘發(fā)72 h,胰腺M(fèi)CP -1 mRNA 的表達(dá)明顯升高,與對照組相比較,差異顯著(P <0.01);而清胰湯治療組胰腺M(fèi)CP-1 mRNA 的表達(dá)明顯降低,與SAP 組相比差異顯著(P <0.05)。

    Figure 4. The effect of QYD on the MPO level in lung of mice with acute pancreatitis. ±s. n =10. △△P <0.01 vs control group;**P <0.01 vs SAP group.圖4 各組肺組織MPO 水平變化

    Figure 5. Expression of p-STAT3 protein in pancreas following the development of acute pancreatitis. Pancreas protein extracts (20 μg)at the indicated time point (72 h)were analyzed by Western blotting using antibody against p-STAT3 and β -actin. ±s. n =3. △△P <0.01 vs control group;**P <0.01 vs SAP group.圖5 各組p-STAT3 蛋白表達(dá)比較

    Figure 6. The effect of QYD on the MCP -1 mRNA expression in pancreas of mice with acute pancreatitis. The total RNA in pancreas was abstracted and reversibly transcribed into cDNA. The cDNA was further analyzed by real-time PCR. ΔCt was used to calculate the level of MCP -1 mRNA. ±s.n =10. △△P <0.01 vs control group;**P <0.01 vs SAP group.圖6 各組胰腺組織MCP-1 mRNA 表達(dá)變化

    討 論

    腹腔內(nèi)注射大劑量L -Arg 復(fù)制小鼠急性胰腺炎,是研究急性胰腺炎及防治措施較為理想的動物模型。我們曾給小鼠腹腔注射不同劑量(2 g/kg、3 g/kg、4 g/kg)的20% L -Arg,發(fā)現(xiàn)小鼠死亡率及造模的成功率與劑量明顯相關(guān)。采用20% L -Arg 以2 g/kg 的劑量給小鼠進(jìn)行腹腔注射,發(fā)現(xiàn)72 h 模型的成功率僅為60%,而4 g/kg 的劑量造膜后72 h 小鼠的死亡率超過了40%。因此我們選用了20% LArg 以3 g/kg 的劑量造模,72 h 后模型組動物可見胰腺腺泡細(xì)胞腫脹,及多處片狀壞死,間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤及出血;肺組織表現(xiàn)為肺泡間隔水腫、增寬,大量炎癥細(xì)胞浸潤;血漿淀粉酶活性、胰腺重量、肺組織勻漿MPO 水平明顯增加,提示腹腔內(nèi)注射大劑量L- Arg(3 g/kg)成功復(fù)制了小鼠急性胰腺炎模型。此法操作簡便,成本低,重復(fù)性好,病變的程度在不同胰腺部位比較一致,克服了其它模型需行剖腹術(shù)等缺點(diǎn),再次證明L -Arg 腹腔注射是復(fù)制急性胰腺炎較為理想的方法[5]。

    STAT3 是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛表達(dá)于多種類型的細(xì)胞和組織中,可被JAKs(Janus kinases)通過酪氨酸磷酸化激活成為p - STAT3,p -STAT3 表達(dá)水平是STAT3 活化程度的指征[7]。對結(jié)腸炎的信號通路研究發(fā)現(xiàn)[8],過度生成的IL -6 首先與IL -6 受體結(jié)合,引發(fā)JAKs 磷酸化活化,繼而導(dǎo)致其下游的STAT3 磷酸化,磷酸化的STAT3(p -STAT3)分子形成二聚體,進(jìn)入細(xì)胞核與特異的DNA序列結(jié)合,調(diào)節(jié)下游相關(guān)靶基因如炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而采用caerulein 聯(lián)合脂多糖誘發(fā)的小鼠SAP 模型[9]也發(fā)現(xiàn):胰腺中STAT3 表達(dá)明顯增強(qiáng),而IL-6 中和抗體可以抑制胰腺STAT3 的活化、減輕SAP 的損傷,提示胰腺STAT3 的活化可能與胰腺炎的病變程度存在著一定的因果關(guān)系。但是STAT3 在AP 發(fā)展中的作用尚不清楚。本課題采用20% L-Arg 復(fù)制小鼠急性胰腺炎模型,觀察SAP 模型胰腺STAT3 活化程度的變化,發(fā)現(xiàn)20% L - Arg注射后72 h,胰腺和肺組織可見明顯的病理損傷,胰腺p-STAT3 表達(dá)明顯增強(qiáng),炎性細(xì)胞因子MCP -1 mRNA 表達(dá)增多,提示胰腺STAT3 活化可能參與SAP 的重癥化。由于在SAP 的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中均發(fā)現(xiàn)MCP-1 上調(diào),MCP-1 在急性胰腺炎的炎癥損傷尤其在急性胰腺炎并發(fā)肺損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示STAT3 活化后進(jìn)入細(xì)胞核可能與特異性的DNA 序列結(jié)合,促進(jìn)其下游MCP-1 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

    清胰湯是大承氣湯的加減方,其功效主要為通里攻下,活血化瘀,在臨床上已廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎。研究發(fā)現(xiàn),清胰湯除了能促使腸道功能恢復(fù)外,同時可以阻止炎癥介質(zhì)IL-6 的釋放[11]。清胰湯是否對IL-6 下游的STAT3 有抑制作用及其機(jī)制尚不清楚。我們采用清胰湯對L -精氨酸所誘發(fā)的SAP小鼠進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn):清胰湯治療組p-STAT3 的表達(dá)明顯減少,提示清胰湯可以抑制胰腺STAT3 的活化。另外清胰湯治療組的胰腺重量、血清淀粉酶活性、MPO 水平明顯降低,胰腺、肺組織學(xué)損傷程度明顯減輕,胰腺M(fèi)CP-1 mRNA 的表達(dá)明顯減少,提示抑制STAT3 的活化可以減輕AP 的胰腺、肺的炎癥性損傷。本研究結(jié)果為SAP 的治療提供有價值的靶點(diǎn),并為闡明清胰湯治療急性胰腺炎的作用和機(jī)制提供理論依據(jù)。

    [1] Mayer J,Rau B,Gansauge F,et al. Inflammatory mediators in human acute pancreatitis:clinical and pathophysiological implications[J]. Gut,2000,47(4):546 -552.

    [2] ?timac D,F(xiàn)i?i E,Mili S,et al. Prognostic values of IL-6,IL-8,and IL-10 in acute pancreatitis[J]. J Clin Gastroenterol,2006,40(3):209 -212.

    [3] 張曉云,汪東劍,余維濤.血清IL -6、IL -8 和TNF -α在重癥急性胰腺炎早期診斷中的臨床意義[J].胰腺病學(xué),2004,4(1):26 -28.

    [4] Atreya R ,Mudter J ,F(xiàn)inotto S ,et al . Blockade of interleukin 6 trans -signaling suppresses T -cell resistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation:evidence in crohn disease and experimental colitis in vivo[J]. Nat Med,2000,6(5):583 -588.

    [5] 劉君君,陳 墾,龍友明,等. L -精氨酸誘導(dǎo)大鼠急性壞死性胰腺炎模型的建立[J].中國藥理學(xué)通報,2009,25(10):1392 -1394.

    [6] 林旭紅,李永渝. 急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療的研究進(jìn)展[J]. 中國病理生理雜志,2010,26(5):1029-1032,1040.

    [7] 鐘敦璟,郭 紅,郝 嘉,等. STAT3 對大鼠重癥急性胰腺炎血清體外作用AT -II SP -C 的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008,30(19):1807 -1809.

    [8] Mitsuyama K,Sata M,Rose-John S. Interleukin-6 trans-signaling in inflammatory bowel disease[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2006,17(6):451 -461.

    [9] Chao KC,Chao KF,Chuang CC,et al. Blockade of interleukin 6 accelerate acinar cell apoptosis and attenuates experimental acute pancreatitis in vivo[J]. Br J Surg,2006,93(3):332 -338.

    [10] Zhou GX,Zhu XJ,Ding XL,et al. Protective effects of MCP-1 inhibitor on a rat model of severe acute pancreatitis[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2010,9(2):201-207.

    [11] 聞慶平,陳海龍,關(guān)風(fēng)林.清胰湯對大鼠重癥急性胰腺炎時急性肺損傷治療作用的觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2003,9(4):302 -306.

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