阻塞性黃疸對(duì)腸上皮細(xì)胞氯離子分泌影響的研究*

陳振勇， 戴紅梅， 楊 鵬， 王延剛， 黃文廣， 馮賢松

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院綜合外科， 湖北 武漢 430022)

阻塞性黃疸對(duì)腸上皮細(xì)胞氯離子分泌影響的研究*

陳振勇△， 戴紅梅， 楊 鵬， 王延剛， 黃文廣， 馮賢松

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院綜合外科， 湖北 武漢 430022)

目的探討阻塞性黃疸(OJ)對(duì)腸上皮細(xì)胞氯離子分泌的影響。方法建立OJ大鼠模型，分別于膽管結(jié)扎7 d(OJ1組)和14 d(OJ2組)后，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血Cl-濃度，取末端回腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，熒光分光光度法測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)Cl-電流的改變，并用Western blotting法分析電壓門(mén)控氯離子通道蛋白2(ClC-2)表達(dá)的變化。結(jié)果OJ1組和OJ2組的血清Cl-濃度分別為(88.67±4.68)mmol/L 和(82.01±6.25)mmol/L，均低于對(duì)照組(均Plt;0.05)。細(xì)胞內(nèi)Cl-相對(duì)濃度，OJ1組(3.14±0.38)和OJ2組(3.55±0.47)均高于對(duì)照組(均Plt;0.05)。對(duì)照組腸上皮細(xì)胞Cl-電流，從-80 mV的(-15.45±7.56)pA/pF升到80 mV的(5.85±0.81)pA/pF，呈外向整流趨勢(shì)。OJ組Cl-平均電流密度絕對(duì)值逐漸減小，與對(duì)照組比較差異顯著(均Plt;0.05)。Western blotting分析顯示ClC-2蛋白表達(dá)條帶在90 kD附近，對(duì)條帶的定量分析表明，OJ1組為0.20±0.04，OJ2組為0.19±0.06，均低于對(duì)照組(0.27±0.06)(均Plt;0.05)，但OJ1、2組間比較沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)。結(jié)論OJ抑制腸腔氯離子分泌，縮小上皮細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度差，減少Cl-外向電流，此作用與細(xì)胞膜上氯離子通道蛋白 2的表達(dá)降低有關(guān)。

黃疸, 梗塞性； 腸細(xì)胞； 氯化物通道

腸上皮具有離子運(yùn)輸和屏障功能，從數(shù)量上說(shuō)，腸腔液體分泌最初由跨上皮的氯離子分泌所驅(qū)動(dòng)，而液體的吸收主要由與營(yíng)養(yǎng)素一起消化吸收的鈉離子所提供，兩者間維持平衡并精密調(diào)控。電解質(zhì)跨上皮運(yùn)輸涉及到膜運(yùn)輸?shù)鞍?，氯通道蛋白即是與腸腔氯化物分泌有關(guān)的一種膜運(yùn)輸?shù)鞍譡1]，其中2型電壓門(mén)控道氯離子通道 (type 2 voltage-gated chloride channel，ClC-2)發(fā)揮重要生理作用[2]。盡管隨著術(shù)前評(píng)估和術(shù)后護(hù)理的進(jìn)展，阻塞性黃疸(obstructive jaundice,OJ)仍保持較高的發(fā)病率和死亡率，其中關(guān)鍵性的病理生理因素是腸屏障功能破壞，腸通透性增加，從而引起全身的內(nèi)毒素血癥[3]。其中的原因并不甚清楚，可能的機(jī)制包括腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的改變、氧化應(yīng)激、上皮細(xì)胞增殖和凋亡平衡的破壞等[4]。OJ能造成全身和腸腔局部的影響，臨床上也可以觀察到OJ患者腸蠕動(dòng)減弱和腸腔液體分泌障礙[5]，OJ對(duì)腸腔液體分泌的影響尚未見(jiàn)更多報(bào)道。我們從與腸腔氯離子分泌有關(guān)的ClC-2著手，探討OJ對(duì)氯離子分泌的影響，為研究OJ影響腸腔離子分泌與屏障功能障礙提供研究基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物與分組

健康Wistar大鼠50 只，雌雄不限，體重250-330 g，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組(n=10)，不作任何操作，14 d后拉脫法處死；OJ1組(n=10)，采用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，開(kāi)腹手術(shù)結(jié)扎切斷膽總管后關(guān)腹，7 d后處死；OJ2組(n=10)同法制造模型，14 d后處死。動(dòng)物腔靜脈穿刺抽血2 mL，應(yīng)用CX5全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)測(cè)定血清氯離子濃度。距回盲部10 cm處環(huán)形切取回腸，取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織數(shù)塊。

2小腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)[6]

組織塊剪碎，使用DMEM培養(yǎng)基[達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基，Gibco]，加入0.15%胰蛋白酶10 mL，培養(yǎng)瓶垂直置于振蕩儀上室溫振蕩消化30 min，用含10%FBS的培養(yǎng)基10 mL終止消化。反復(fù)吹打消化后的細(xì)胞液5 min，將消化溶液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 000 r/min離心6 min，棄上清。加入細(xì)胞清洗液，再次吹打5 min，1 000 r/min，離心5 min。重復(fù)4次。用培養(yǎng)液重懸沉淀，種植于以2%明膠包被的24孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液1次，培養(yǎng)7 d傳3-4代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3腸上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度的測(cè)定[7]

熒光分光光度法測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度。細(xì)胞懸液加入2 mL比色杯，加入氯離子敏感的熒光染料(MQAE， Molecular Probes)終濃度為5 mmol/L，于37 ℃2 h后用熒光光度計(jì)(RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司)測(cè)量熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm，每10 min計(jì)數(shù)1次。通過(guò)熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算Cl-濃度。

4全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞Cl-電流的改變

參照文獻(xiàn)[8]方法，培養(yǎng)細(xì)胞靜置48 h后細(xì)胞懸液滴片，孵箱中4 h細(xì)胞鋪滿(mǎn)蓋玻片后開(kāi)展膜片鉗實(shí)驗(yàn)。拉制電極使其阻抗為3-4 MΩ。在全細(xì)胞模式下，用EPC-9膜片鉗放大器(HEKA，Lambrecht)檢測(cè)氯通道電流。鉗制電壓0 mV，測(cè)試電壓-80 mV～+80 mV，階躍10 mV，每個(gè)刺激保持500 ms，然后復(fù)極化到-80 mV。信號(hào)為Pulse軟件收集并存儲(chǔ)，實(shí)驗(yàn)圖形采用Igor Pro分析軟件(Version 3.3)進(jìn)行分析處理。

5腸上皮細(xì)胞ClC-2蛋白表達(dá)的變化

Western blotting分析。取黏膜組織100 mg，采用BCA法用紫外可見(jiàn)分光光度儀(Waters)測(cè)定蛋白濃度，取樣本10 μL預(yù)染，加入緩沖液；煮沸，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離。取出硝酸纖維膜(Costar)，染色，用含TBS-T洗膜4次后封閉。加入兔抗鼠CLC-2Ⅰ抗蛋白(Sigma)(1∶300稀釋)，以β-actin(武漢博士德產(chǎn)品)為內(nèi)參照。加入Ⅱ抗〔四甲基異硫酸羅丹明(TRITC)-山羊抗兔IgG，北京中山生物技術(shù)有限公司〕孵育。暗室下膠片顯影，掃描。Olympus BX41圖像采集系統(tǒng)收集圖片信息分析灰度。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1動(dòng)物血清Cl-濃度的改變

血清Cl-濃度即是細(xì)胞外Cl-濃度，結(jié)果表明OJ后細(xì)胞外Cl-濃度均低于對(duì)照組，并且OJ2組更低于OJ1組，差異顯著(均Plt;0.05),說(shuō)明隨時(shí)間推移，梗阻程度加深，細(xì)胞外Cl-濃度下降更嚴(yán)重，見(jiàn)表1。

表1 OJ前后血清Cl-濃度的變化

2體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度的變化

熒光分光光度法測(cè)量的熒光強(qiáng)度間接反應(yīng)上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度的變化，見(jiàn)表2。OJ組的熒光強(qiáng)度均明顯高于對(duì)照組，并且OJ2組高于OJ1組(均Plt;0.05)。

表2 體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度的變化

3腸上皮細(xì)胞Cl-電流的改變

由于OJ后細(xì)胞內(nèi)外Cl-濃度均發(fā)生改變，因此必然存在Cl-電流的變化。通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞Cl-電流，發(fā)現(xiàn)正常情況下氯電流隨膜的去極化逐漸由負(fù)值向正值轉(zhuǎn)化，從-80mV的(-15.45±1.70) pA/pF升到80mV的(5.85±0.81) pA/pF，呈外向整流趨勢(shì)。同時(shí)，OJ1組從(-12.16±1.15)pA/pF上升到(4.69±0.65)pA/pF，OJ2組分別為(-11.55±1.26 )pA/pF和(4.57±0.76) pA/pF。Cl-平均電流密度變化的絕對(duì)值，OJ組均小于對(duì)照組(均Plt;0.05)，但OJ1組與OJ2組間比較沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)，見(jiàn)圖1。

4腸上皮細(xì)胞ClC-2蛋白表達(dá)的變化

細(xì)胞內(nèi)外Cl-濃度和電流的變化與細(xì)胞表面的氯離子通道蛋白有關(guān)，ClC-2是廣泛分布的氯通道家族之一，已證實(shí)在胃壁細(xì)胞和小腸、結(jié)腸上皮細(xì)胞有分布，定位于胃腸道上皮細(xì)胞膜尖端[8]。Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)ClC-2表達(dá)條帶在90 kD附近，見(jiàn)圖2A，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[9]。

Figure 1. The changes of Cl- current among the three groups.

Figure 2. ClC-2 protein expression±s.n=10.△Plt;0.05 vs control group; #Plt;0.05 vs OJ1 group.

通過(guò)圖像分析儀測(cè)量條帶的相對(duì)灰度值，定量結(jié)果分析表明，OJ1組為0.20±0.04，OJ2組為0.19±0.06，均顯著低于對(duì)照組(0.27±0.06)，Plt;0.05，但兩實(shí)驗(yàn)組間比較無(wú)差異顯著(Pgt;0.05)，見(jiàn)圖2B。

討 論

OJ對(duì)機(jī)體的影響是全方位的，僅就胃腸道而言，能破壞腸黏膜屏障，其作用與腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白數(shù)量的減少和再分布有關(guān)[10]。OJ對(duì)腸黏膜屏障的損傷是關(guān)鍵性啟動(dòng)因素，引起細(xì)菌及內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而引起炎性細(xì)胞因子的“瀑布樣”效應(yīng)，形成所謂“腸源性膿毒癥”。臨床上可以觀察到OJ患者腸蠕動(dòng)減弱和腸腔液體分泌障礙，OJ是如何影響腸腔離子分泌尚未見(jiàn)更多研究。氯離子通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和氯離子通道參與了幾乎已知的各種生物過(guò)程[5]，因此我們從氯離子入手，探討OJ對(duì)腸腔離子分泌的影響。

腸腔液體分泌依靠細(xì)胞內(nèi)外離子濃度差及腸上皮細(xì)胞的跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)，氯離子的通透性受胞外氯離子濃度的影響，許多陽(yáng)離子如K+、Na+等也可通過(guò)氯通道。我們研究發(fā)現(xiàn)OJ降低細(xì)胞外Cl-濃度，升高細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度，縮小細(xì)胞內(nèi)外Cl-濃度差，且這種濃度差在OJ2組大于OJ1組，說(shuō)明隨OJ時(shí)間延長(zhǎng)Cl-分泌影響更大。

臨床上OJ患者出現(xiàn)水、電解質(zhì)紊亂較常見(jiàn)，其中也包括Cl-失衡。原因在于液體、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入不足；合并感染導(dǎo)致嘔吐或發(fā)熱，液體丟失過(guò)多；內(nèi)毒素血癥和高膽紅素血癥致腎臟受損等[11]。我們的研究也證實(shí)隨OJ程度的加深，對(duì)Cl-分泌的抑制程度更大。

為更深入了解OJ影響Cl-分泌的機(jī)制，我們從氯離子電流和氯通道蛋白角度作進(jìn)一步研究。細(xì)胞內(nèi)外Cl-濃度的變化可激活一種外向電流，即氯離子電流，該電流具有典型的外向整流特性。通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)顯示，對(duì)照組Cl-平均電流密度從-80 mV的(-15.45±7.56 )pA/pF升到80 mV的(5.85±0.81) pA/pF，而OJ1組從(-12.16±4.68)pA/pF升到(4.69±0.65)pA/pF，OJ2組從(-11.55±6.25) pA/pF升到(4.57±0.76) pA/pF，OJ后腸上皮細(xì)胞Cl-平均電流密度變化幅度明顯小于對(duì)照組，說(shuō)明OJ后Cl-外向電流受抑制，這也與細(xì)胞內(nèi)外Cl-濃度差減小是一致的。這種外向電流普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，對(duì)維持細(xì)胞容積的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞的電活動(dòng)，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能發(fā)揮重要作用[12]。Cl-外向電流的破壞也將損害腸上皮細(xì)胞的各種生理功能。

腸腔氯化物分泌和氯離子電流的產(chǎn)生與腸上皮細(xì)胞氯通道蛋白有關(guān)。氯通道是指分布于細(xì)胞膜上的一種通道蛋白，其不僅運(yùn)輸氯離子，還廣泛地轉(zhuǎn)運(yùn)其它陰離子或離子團(tuán)。根據(jù)調(diào)節(jié)因子的差異，將氯通道分為6類(lèi)：電壓門(mén)控氯通道(voltage- gated chloride channel，ClC型氯通道)、囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子、鈣激活氯通道、p64相關(guān)氯通道、容積調(diào)控陰離子通道和配體門(mén)控氯通道[13]。ClC型氯通道包括9個(gè)亞型，研究比較多的是ClC-2通道。ClC-2廣泛存在于機(jī)體的細(xì)胞膜和胞內(nèi)細(xì)胞器膜上[14]，在胃腸道上皮細(xì)胞內(nèi)定位于細(xì)胞膜尖端[15]，結(jié)構(gòu)上為同源二聚體，受電壓和H+、Cl-激活。在細(xì)胞電活動(dòng)、容積調(diào)節(jié)、跨上皮物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)、細(xì)胞免疫應(yīng)答[16]和細(xì)胞凋亡[17]中都發(fā)揮一定作用。

我們進(jìn)一步研究OJ對(duì)腸上皮細(xì)胞ClC-2通道的影響。結(jié)果表明ClC-2蛋白表達(dá)條帶在90 kD左右，通過(guò)對(duì)表達(dá)條帶的定量分析也發(fā)現(xiàn)OJ組的ClC-2的表達(dá)量低于對(duì)照組，也說(shuō)明OJ抑制了ClC-2的表達(dá)。這也與細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度差縮小，氯離子外向電流減小一致。

ClC-2不僅存在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞內(nèi)也有大量存在，兩者間的ClC-2能循環(huán)利用，其作用類(lèi)似于起運(yùn)輸作用的脂質(zhì)筏，因此ClC-2運(yùn)輸至膜及其在膜內(nèi)傳輸是調(diào)節(jié)ClC-2活性的方式之一[18]。ClC-2氯通道在因缺血受損的腸黏膜修復(fù)中具有重要作用[19]。研究表明ClC-2與環(huán)繞黏膜上皮細(xì)胞頂側(cè)的緊密連接具有共同的分布區(qū)域[20]，OJ能同時(shí)破壞緊密連接蛋白和ClC-2，是否可以推測(cè)OJ損傷腸黏膜屏障與ClC-2有關(guān)。探討OJ對(duì)腸腔離子分泌的影響，也將為OJ破壞腸黏膜屏障的機(jī)制尋找到新的突破方向。

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AD大鼠模型中tau基因缺失引起軸突變性

Tau病變包括各種以細(xì)胞內(nèi)存在tau蛋白聚合物、有進(jìn)行性癡呆和錐體外系癥狀為特征的進(jìn)行性神經(jīng)退行性病變，如額顳葉癡呆、FTDP-17、PSP、CBD、Pick's病以及阿爾茨海默病(AD)。Tau病變發(fā)病機(jī)制的一個(gè)中心問(wèn)題是tau蛋白功能障礙如何導(dǎo)致神經(jīng)退化。Dawson HN等早前已經(jīng)證實(shí)tau 蛋白的缺失與微管失穩(wěn)有關(guān)，并損傷軸突的外向生長(zhǎng)。他們由此推測(cè)有功能的tau蛋白缺失可能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)更易于發(fā)生例如突變的β-淀粉樣前體蛋白(β-APP)的過(guò)度表達(dá)以及外傷性腦損傷等的繼發(fā)性損傷。為此，他們將敲除tau基因的小鼠與過(guò)度表達(dá)突變?nèi)祟?lèi)APP(APP670,671，Asw)的小鼠雜交，建立了一個(gè)新的小鼠模型Asw/mTau-/-，用以證實(shí)tau基因的缺失可引起神經(jīng)退行性病變。在tau基因被敲除的小鼠中，APP670,671的過(guò)度表達(dá)引出軸突球狀體的廣泛形成。他們注意到，能自身產(chǎn)生tau的小鼠若過(guò)度表達(dá)APP670,671，其球狀體的形成僅僅與Aβ沉積斑塊有關(guān)，而Asw/mTau-/-小鼠的球狀體不僅形成于Aβ沉積斑塊周?chē)?，還形成于白質(zhì)束和神經(jīng)纖維網(wǎng)中，與Aβ沉積斑塊相關(guān)和營(yíng)養(yǎng)障礙性神經(jīng)網(wǎng)軸突球狀體形成均為AD的顯著特征。因此，tau的缺失可以造成神經(jīng)退行性病變，過(guò)度表達(dá)突變的APP動(dòng)物模型中tau的缺失加重神經(jīng)元的損傷，應(yīng)考慮針對(duì)tau 病變?yōu)榘悬c(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病的治療方法。

Neuroscience, 2010, 169(1):516-531(逯 丹)

Effectsofobstructivejaundiceonenterocytechloridionsecretioninrats

CHEN Zhen-yong, DAI Hong-mei, YANG Peng, WANG Yan-gang, HUANG Wen-guang, FENG Xian-song

(DepartmentofGeneralSurgery,UnionHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China.E-mail:xhczy@126.com)

AIM: To investigate the effects of obstructive jaundice (OJ) on enterocyte chloridion secretion in rats.METHODSThe OJ model of rats was set up. The rats were divided into OJ1 group and OJ2 group randomly. The animals in OJ1 group were sacrificed by exsanguination 7 days after operation and the rats in OJ2 group were sacrificed 14 days after operation. The Cl-concentration in peripheral blood was detected. The epithelial cells in the terminal ileum mucosas were culturedinvitro. The concentration of intracellular Cl-was detected by fluorospectrophotometry. The Cl-current was measured by whole-cell patch clamp experiments. Western blotting was used to examine the change of voltage-gated Cl-channel 2 protein (ClC-2) and the images were analyzed by image analysis system and statistical software quantitatively.RESULTSThe serum Cl-concentration in OJ1 group and OJ2 group were obviously lower than that in control group [(88.67±4.68) mmol/L and (82.01±6.25) mmol/Lvs(95.57±7.51) mmol/L, bothPlt;0.05]. The intracellular Cl-relative concentrations in OJ1 group and OJ2 group were higher than that in control group (3.14±0.38 and 3.55±0.47vs2.69±0.41,bothPlt;0.05). The Cl-current of normal epithelial cells displayed outward rectification, and transformed negative value into positive value following cell membrane depolarization. The Cl-current was (-15.45±7.56) pA/pF and (5.85±0.81) pA/pF when voltage was -80 mV and 80 mV. The ranges of upgrade of absolute values of average electric current density in OJ groups were lower than those in control group (allPlt;0.05). Western blotting analysis showed that the ClC-2 protein generated a broad band about 90 kD. The average gradations of Western blotting images were lower in OJ groups than that in control group (0.20±0.04 and 0.19±0.06vs0.27±0.06, bothPlt;0.05). However, no difference between the 2 OJ groups was observed (Pgt;0.05).CONCLUSIONThe chloridion secretion of intestinal epithelium is restrained in rats with OJ. The concentration gradient between exterior and interior of epithelial cells is decreased, and the Cl-outward current is reduced. All of above are concerned with downregulation of ClC-2 protein in cell membrane.

Jaundice,obstructive; Enterocytes; Chloride channels

1000-4718(2011)11-2194-05

R364.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.030

2011-05-17

2011-08-30

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2010CDB08005)

△ 通訊作者 Tel：027-85351530;E-mail：xhczy@126.com