自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞損傷中的作用*

孔曉霞， 張宏宇， 鐘加滕， 康勁松， 孫連坤△

(1溫州醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江 溫州 325035; 2吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞損傷中的作用*

孔曉霞1， 張宏宇2， 鐘加滕2， 康勁松2， 孫連坤2△

(1溫州醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江 溫州 325035;2吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)在H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用。方法實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對(duì)照組、10 mmol/L 3-MA組、1 mmol/L H2O2組、1 mmol/L H2O2+10 mmol/L 3-MA組。MTT法檢測(cè)各組的U251細(xì)胞增殖率；MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬空泡的變化；Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用3-MA對(duì)U251細(xì)胞無(wú)明顯影響。H2O2作用組U251細(xì)胞增殖率明顯降低，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬空泡，細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞凋亡率增加。3-MA與H2O2聯(lián)合作用于U251細(xì)胞時(shí)，與單獨(dú)應(yīng)用H2O2組相比，抑制了H2O2引起的胞內(nèi)自噬空泡的積聚，但細(xì)胞凋亡率明顯增加。結(jié)論自噬抑制劑3-MA能夠一定程度地抑制H2O2誘導(dǎo)的U251細(xì)胞自噬，但促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，表明自噬在H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞損傷過(guò)程中很可能起到保護(hù)性作用。

自呑噬作用； U251細(xì)胞；3-甲基腺嘌呤; 過(guò)氧化氫

自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程[1,2]。已有研究表明自噬在饑餓、氧化應(yīng)激、缺氧等條件下對(duì)細(xì)胞具有一定程度的保護(hù)作用[3,4]。但是，過(guò)度激活的自噬會(huì)引起程序性細(xì)胞死亡，導(dǎo)致細(xì)胞生存率下降，這種細(xì)胞死亡方式被定義為II型細(xì)胞程序性死亡，即自噬性細(xì)胞死亡(autophagic cell death)[5,6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用H2O2復(fù)制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞損傷模型，并利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)協(xié)同作用，初步探討自噬在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞氧化損傷中的作用。

材 料 和 方 法

1神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室保存，細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基(10% Hyclone新生牛血清，IMDM培養(yǎng)液，pH 7.4)中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2實(shí)驗(yàn)分組

將U251細(xì)胞分為以下4組：正常對(duì)照組、3-MA組、H2O2組和H2O2+3-MA組。H2O2和3-MA(Sigma)的終濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L。

3噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞生存率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，以每孔100 μL、1×104細(xì)胞數(shù)接種于96板，12 h后按照實(shí)驗(yàn)分組加藥，20 h后加入MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，570 nm測(cè)其吸光度值。

4MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬空泡變化

丹酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC) 是自噬空泡的標(biāo)志物，通過(guò)MDC染色可以觀察判斷細(xì)胞自噬過(guò)程的發(fā)生[7]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，以5×104cells/well數(shù)接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組在藥物處理12 h后，PBS洗2遍，棄上清，以4%冰冷的多聚甲醛，4 ℃下固定15 min，PBS洗2遍，加入終濃度50 μmol/ L MDC (Sigma)，37 ℃孵育60 min，PBS洗2遍。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬空泡的變化并進(jìn)行熒光定量分析。

5Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，以每孔5×104cells/well數(shù)接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組在藥物處理后12 h，PBS洗2遍，棄上清，加入終濃度1 mg/L的 Hoechst 33342 (Sigma)染色，37 ℃孵育15 min，PBS洗2遍，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色質(zhì)凝集及形態(tài)變化并統(tǒng)計(jì)熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，以5×106cells/well數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組在藥物處理后12 h，PBS洗2遍，收集細(xì)胞，棄上清，分別加入終濃度1 mg/L PI和Annexin V-FITC (Sigma)，37 ℃孵育15 min，PBS洗2遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

13-MA和H2O2對(duì)U251細(xì)胞增殖率的影響

單獨(dú)應(yīng)用3-MA作用于U251細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖率未見(jiàn)明顯變化。單獨(dú)應(yīng)用1 mmol/L H2O2作用24 h，細(xì)胞增殖率明顯下降，為(76.4±3.9)%,Plt;0.01；當(dāng)3-MA與H2O2聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞增殖率與單獨(dú)應(yīng)用H2O2組相比明顯降低，為(63.7±5.2)%,Plt;0.05，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The vitality of U251 cells treated with H2O2 and /or 3-MA for 24 h .±s.n=3.**Plt;0.01 vs control group；#Plt;0.05 vs H2O2 group.

2MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬空泡變化

MDC染色結(jié)果表明單獨(dú)應(yīng)用3-MA作用于U251細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯自噬空泡出現(xiàn)，熒光定量分析平均熒光強(qiáng)度為(86.2±23.4)%，與對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度[(78.1±16.3)%]相比無(wú)明顯差異。單獨(dú)應(yīng)用H2O2作用12 h，細(xì)胞內(nèi)大量自噬空泡積聚，平均熒光強(qiáng)度為(219.6±59.8)%,Plt;0.01，表明有自噬發(fā)生；當(dāng)3-MA與H2O2聯(lián)合作用時(shí)，與單獨(dú)應(yīng)用H2O2組相比，自噬空泡明顯減少，平均熒光強(qiáng)度為(108.5±37.2)%,Plt;0.01，見(jiàn)圖2。

3Hoechst33342染色檢測(cè)H2O2和3-MA對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響

單獨(dú)應(yīng)用3-MA作用于U251細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，無(wú)明顯細(xì)胞凋亡發(fā)生，Hoechst 33342染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(1.8±0.3)%。單獨(dú)應(yīng)用H2O2作用12 h，細(xì)胞核碎裂，染色質(zhì)凝聚，引起細(xì)胞凋亡，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(8.7±2.5)%,Plt;0.01；當(dāng)3-MA與H2O2聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞凋亡與單獨(dú)應(yīng)用H2O2組相比顯著增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(14.5±3.8)%,Plt;0.01，見(jiàn)圖3。

Figure 2. MDC staining of the autophagic vacuoles in U251 cells treated with H2O2 and/or 3-MA for 12 h (×800).

Figure 3. Hoechst 33342 staining of cell apoptotic chromatin condensation in U251 cells treated with H2O2 and/or 3-MA for 12 h (×600).

4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用3-MA作用于U251細(xì)胞時(shí)細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化。單獨(dú)應(yīng)用H2O2作用12 h，細(xì)胞凋亡率明顯增加，為(9.6±1.5)%,Plt;0.01；當(dāng)3-MA與H2O2聯(lián)合作用時(shí)，與單獨(dú)應(yīng)用H2O2組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增加，為(15.4±3.1)%,Plt;0.01，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Flow cytometry analysis of cell apoptotic ratio of U251 cells treated with H2O2 and/or 3-MA for 12 h. **Plt;0.01 vs control group；#Plt;0.05 vs H2O2 group.

討 論

有研究表明相同誘導(dǎo)因素在不同細(xì)胞中可分別誘發(fā)自噬或凋亡；近年來(lái)越來(lái)越多的研究提示二者在某些情況下可以相互拮抗或促進(jìn)，可先后發(fā)生或同時(shí)共存于同一細(xì)胞，參與自噬和凋亡的分子也可能存在交叉，這些分子在自噬與凋亡兩種程序性細(xì)胞死亡中可發(fā)揮正向或負(fù)向作用[8]。近來(lái)有報(bào)道表明活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是自噬發(fā)生過(guò)程中的信號(hào)分子，高水平的ROS能氧化細(xì)胞脂質(zhì)，DNA和蛋白，并且能引起線粒體，溶酶體和其它的細(xì)胞器功能紊亂。然而通過(guò)自噬降解和再循環(huán)受損的細(xì)胞蛋白等不同的防御機(jī)制能抵抗這種氧化應(yīng)激[9]。然而，自噬在細(xì)胞中的作用以及自噬與凋亡之間的關(guān)系依然存在著爭(zhēng)議，相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步闡明。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2作用于U251細(xì)胞，引起了U251細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，提示氧化損傷過(guò)程中兩種程序性細(xì)胞死亡形式同時(shí)存在并可能相互影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2作用于U251細(xì)胞時(shí)，能明顯抑制U251細(xì)胞增殖(Plt;0.01)；而自噬抑制劑3-MA與H2O2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞增殖率卻沒(méi)有改善，反而有進(jìn)一步下降，推測(cè)自噬在此過(guò)程中可能起到保護(hù)作用。激光共聚焦顯微鏡觀察Hoechst 33342染色，H2O2作用12 h后，細(xì)胞核發(fā)生回縮，染色質(zhì)凝集，表明H2O2能引起U251細(xì)胞凋亡。同時(shí)通過(guò)MDC染色發(fā)現(xiàn)，H2O2作用后細(xì)胞內(nèi)有大量自噬空泡積聚，而3-MA與H2O2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，明顯抑制了自噬的發(fā)生。3-MA與H2O2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞核凋亡顯著增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明3-MA的聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率顯著增加。上述結(jié)果表明，自噬抑制劑3-MA能夠抑制H2O2引起的細(xì)胞自噬，卻促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，暗示自噬在U251細(xì)胞氧化損傷過(guò)程中很可能起到了一種保護(hù)作用。有研究表明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或生長(zhǎng)因子缺乏時(shí)，機(jī)體可以通過(guò)自噬方式為細(xì)胞提供能量，促進(jìn)細(xì)胞存活。Scherz-Shouval等[10]的研究表明，ROS能夠調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)匱乏引起的自噬，并且是一種明確的促生存機(jī)制；營(yíng)養(yǎng)匱乏能夠?qū)е虏糠纸?jīng)由ClassIII/PI3K途徑的線粒體活性氧積聚，激活自噬基因Atg4，這很可能是ROS誘導(dǎo)自噬發(fā)生的關(guān)鍵。通過(guò)化學(xué)或者生理學(xué)手段抑制自噬，能夠啟動(dòng)HeLa細(xì)胞中線粒體外膜透化以及進(jìn)一步的caspase活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。我們推測(cè)，在自噬和凋亡并行發(fā)生的情況下，自噬更趨向于是一種通過(guò)降解以及再循環(huán)來(lái)提供能量的促生存機(jī)制。

以上結(jié)果表明，自噬抑制劑3-MA抑制了H2O2引起的細(xì)胞自噬，卻促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，說(shuō)明自噬的發(fā)生能夠在一定的程度上減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。進(jìn)一步研究自噬與凋亡的關(guān)系，通過(guò)抑制細(xì)胞自噬促進(jìn)凋亡性細(xì)胞死亡，很可能成為腫瘤治療中的一種新策略。

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Roleofautophagyinhibitor3-methyladenineintheinjuryofU251cellsinducedbyH2O2

KONG Xiao-xia1, ZHANG Hong-yu2, ZHONG Jia-teng2, KANG Jin-song2, SUN Lian-kun2

(1TeachingCenterofFunctionalExperiment,WenzhouMedicalSchool,Wenzhou325035,China;2DepartmentofPathophysiology,NormanBethuneSchoolofMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China.E-mail:sunlk@jlu.edu.cn)

AIM: To investigate the role of autophagy inhibitor 3-methyladenine(3-MA) in the injury of U251 glioma cells induced by H2O2.METHODSThe following groups in this study were set up: control group, 10 mmol/L 3-MA group, 1 mmol/L H2O2group and 1 mmol/L H2O2+10 mmol/L 3-MA group. The viability of U251 cells in each group was detected by MTT assay. Autophagic vacuoles in the cells were observed by staining with MDC. The cells were stained with Hoechst 33342 to determine the chromatin condensation. Cell apoptotic ratio was measured by flow cytometry analysis.RESULTSCompared with control group, no effect of 3-MA on the viability of U251 cells was observed. In H2O2group, the cell viability decreased and cell apoptotic ratio increased.The autophagic vacuoles and nuclear chromatin condensation in the cells were also detected. Compared with H2O2group, addition of 3-MA inhibited the increase in autophagic vacuoles but exacerbated the apoptosis.CONCLUSIONAutophagy inhibitor 3-MA inhibits autophagy partially, but exacerbates apoptosis in U251 cells, indicating that autophagy exerts protective effect in the process of injury in U251 cells induced by H2O2.

Autophagocytosis; U251 cells; 3-methyladenine; Hydrogen peroxide

1000-4718(2011)04-0695-04

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.014

2010-10-19

2011-02-16

吉林省科技廳資助項(xiàng)目(No.200705373)；溫州醫(yī)學(xué)院科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.QTJ09014)

△通訊作者Tel: 0431 - 85619485; E - mail: sunlk@jlu.edu.cn