人核心蛋白聚糖基因靶向肺癌細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

呂俊鋒 杜珍武 張玉成 張桂珍 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 30033)

肺癌的分子靶向藥物治療是近年新興的一種治療手段,具有高度選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞而不殺傷或僅很少損傷正常細(xì)胞的特點(diǎn),然而,恰恰由于靶向治療是為攻擊特異性靶分子而設(shè)計(jì),所以須找到合適靶點(diǎn)才能發(fā)揮其療效。研究發(fā)現(xiàn)核心蛋白聚糖 (decorin,DCN)在腫瘤細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用〔1〕。因此,運(yùn)用特定的基因表達(dá)調(diào)控元件,使 DCN基因特異地在腫瘤細(xì)胞中表達(dá),從而提高DCN基因治療安全性。人分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制劑 (human secretory-leukop rotease inhibitor,hSLPI)是由呼吸道及生殖道黏膜上皮分泌的蛋白質(zhì),在非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)中高表達(dá),hSLPI作為基因啟動子具有相對更好的特異性,該基因啟動子控制的特異表達(dá)及殺傷作用已在動物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)〔2〕。本實(shí)驗(yàn)采用基因克隆技術(shù)從人外周血白細(xì)胞的基因組中釣取 SLPI啟動子片段構(gòu)建并鑒定 pcDNA3.1-hSLPI-decorin的真核表達(dá)體系,為進(jìn)一步研究 decorin靶向基因治療肺癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌 A549細(xì)胞、質(zhì)粒 pcDNA-decorin、細(xì)菌克隆宿主大腸桿菌 JM109和質(zhì)粒 pcDNA3.1來自本實(shí)驗(yàn)室。各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶購于大連寶生物工程有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA marker購自天根生化科技有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購自維特潔生化技術(shù)有限公司。抗人DCN單克隆抗體購于 R&D公司;Lipofectamine 2000購于 Invitrogen公司;G418購于寶泰克生物工程公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank中 SLPI基因的 cDNA序列,上游 5′末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的序列設(shè)計(jì)一對引物,上游引物:5′-TTCGACGCGTCTCACTGCAGCCTCAAAC-3′并在 5′端引入 MluⅠ酶切位點(diǎn);下游引物:5′-TTCTAGCTAGCGGTGAAGGCAGGAGTGAC-3′并在 5′端引入 NheⅠ酶切位點(diǎn)。由上海生工公司合成。

1.3 SLPI基因啟動子的克隆與鑒定 取新鮮的人外周血2 m l,按試劑盒說明提取細(xì)胞基因組 DNA,并以此為模板,應(yīng)用TaqDNA聚合酶和上述引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 SLPI基因啟動子序列。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5 m in,94℃變性1 min,58℃退火 45 s,72℃延伸 1 m in 40 s,共 35個循環(huán),最后 72℃延伸10 m in。PCR產(chǎn)物通過 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定。DNA凝膠回收試劑盒回收全部 PCR產(chǎn)物,得到的目的片段克隆到 pcDNA3.1載體中,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109,經(jīng)藍(lán)白篩選,隨機(jī)挑取白色菌落,搖菌后提取質(zhì)粒,以 MluⅠ和 NheⅠ雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,進(jìn)行酶切鑒定,鑒定正確后得到 pcDNA3.1-SLPI菌株,再送交上海生工測序中心鑒定 。

1.4 雙酶切 pcDNA3.1-decorin和 pcDNA3.1-hSLP I連接并轉(zhuǎn)化 用 EcoR I、Xba I雙酶切質(zhì)粒 pcDNA3.1-decorin,凝膠回收DCN基因片段,通過 T4連接酶定向克隆入Mlu I和 Nhe I雙酶切測序正確的載體 pcDNA3.1-hSLPI基因啟動子 SLPI的下游,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到已置備好的感受態(tài) JM109菌中,并且涂布在含有氨卞青霉素的LB平板上,過夜后挑取單克隆菌,搖床過夜,質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-hSPL I-decorin。

1.5 質(zhì)粒 pcDNA3.1-hSLPI-decorin的酶切鑒定 pcDNA3.1-hSPL I-decorin陽性重組克隆通過 Mlu I和 Nhe I、EcoR I和 Xba I酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳,進(jìn)行初步鑒定。

圖 1 SLPI啟動子 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖 2 pcDNA3.1-SLPI酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2 結(jié) 果

2.1 SLPI基因啟動子的克隆與鑒定

2.1.1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 見圖 1,在約 1 250 bp處獲得 SLPI基因啟動子單一目的條帶。

2.1.2 酶切鑒定 pcDNA3.1-SLPI陽性重組克隆通過 Mlu I和 Nhe I雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果見圖 2,在約 1 250 bp處切出目的片段。

2.1.3 序列測定 經(jīng)酶切、PCR鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與 GenBank中的 SLPI基因上游 5′末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列比對,序列完全一致,測序結(jié)果為:

2.2 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-hSLPI-deco rin的酶切鑒定 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-hSLPI-decorin經(jīng)MluⅠ和 NheⅠ、EcoR Ⅰ和 XbaⅠ酶切后 1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果可見酶切下 1 000 bp的DCN基因片段及 1 250 bp處獲得 SLPI基因啟動子的條帶,見圖3。

圖 3 pcDNA3.1-hSLPI-decorin酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖譜

3 討 論

DCN是在細(xì)胞外基質(zhì)中存在的小分子蛋白聚糖,1978年首次由美國國立衛(wèi)生研究院骨科研究所的 Fisher教授分離、純化。1986年 Krusius等〔4〕通過提取人胚胎成纖維細(xì)胞系IMR290RNA、構(gòu)建 DNA文庫,成功克隆 DCN基因并測序鑒定。研究發(fā)現(xiàn),DCN在體外可抑制各種組織來源的腫瘤細(xì)胞增殖,尤其是 hNSCLC細(xì)胞,國外學(xué)者先給裸鼠接種 A431肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株,出現(xiàn)接種的瘤體后,多次瘤體內(nèi)注射 DCN基因的腺病毒載體。結(jié)果移植瘤體生長減緩,瘤體與正常組織分界變清楚,并且在鱗狀細(xì)胞癌的移植瘤體內(nèi)出現(xiàn)了數(shù)個角化珠〔5〕。也就是 DCN基因在抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時(shí),還有促進(jìn)細(xì)胞分化的作用。Araki等〔6〕進(jìn)一步報(bào)道,巨細(xì)胞病毒介導(dǎo)的 DCN cDNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231,能表達(dá) DCN,可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長、運(yùn)動和轉(zhuǎn)移,骨轉(zhuǎn)移下降了 90%,這些結(jié)果表明DCN對腫瘤轉(zhuǎn)移有預(yù)防作用,并可能最終導(dǎo)致對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的更好的治療。

文獻(xiàn)〔4〕顯示 SLPI基因在各種 NSCLC患者的癌組織中呈過量表達(dá),在肝中表達(dá)極弱,相比于其他肺癌特異性啟動子,SLP I基因啟動子調(diào)控的肺癌組織類型更廣。Maemondo等〔7〕應(yīng)用該啟動子調(diào)控腫瘤選擇性完全復(fù)制型腺病毒治療NSCLC取得較好的特異抗瘤效果,該研究為尋求針對肺癌的更有效的腫瘤基因治療、最大限度地避免對正常組織的損傷打下基礎(chǔ)。

為尋求針對肺癌的更有效的腫瘤基因治療,最大限度地避免對正常組織的損傷,本研究選用 SLPI基因啟動子作為NSCLC基因治療的靶開關(guān)。通過 PCR方法從人外周血基因組中釣取 1.2 kb的 SLPI啟動子,測序結(jié)果證實(shí)與 GenBank上 SLPI基因上游 5′末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的序列完全一致。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建 SLP I啟動子調(diào)控下的DCN報(bào)告基因表達(dá)載體,最終成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-hSLPI-decorin,這為進(jìn)一步研究DCN靶向治療肺癌作用及其抑癌機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 Reed CC,Gauldie J,Iozzo RV.Supp ression of tumorigenicity by adenovirus-mediated gene transfer of decorin〔J〕.Oncogene,2002;21(23):3688-95.

2 Nukiwa T,Suzuki T,Fukuhara T,et a l.Secretory leukocyte pep tidase inhibitor and lung cancer〔J〕.Cancer Sci,2008;99(5):849-55.

3 Kr usius T,Ruoslahti E.Primary structure of an extracellular matrix p roteoglycan core p riein deduced from clone cDNA〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83(20):7683-7.

4 Ameshima S,Ishizaki T,Demura Y,et a l.Increased secretory leukop rotease inhibitor in patientswith nons mall cell lung carcinoma〔J〕.Cancer,2000;89(7):1448.

5 Reed CC,Gauldie J,Iozzo RV.Supp ression of tumorigenicity by adenovirus mediated gene transfer of decorin〔J〕.Oncogene,2002;21(23):3688-95.

6 Araki K,Wakabayashi H,Shintani K,et a l.Decorin supp resses bone metastasis in a breast cancer cell line〔J〕.Oncology,2009;77(2):92-9.

7 Maemondo M,Saijo Y,Narumi K,et a l.Gene therapy with secretory leukop rotease inhibitor p romoter-controlled rep lication-competent adenovirus for non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Res,2004;64(13):4611.