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    駱駝蓬靈單獨和與洗必泰聯(lián)合對抗金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物膜的抗菌活性研究

    2011-11-18 05:50:02申鳳鴿邢明勛劉麗慧等
    湖北農業(yè)科學 2011年16期
    關鍵詞:洗必泰協(xié)同作用抗菌活性

    申鳳鴿 邢明勛 劉麗慧等

    摘要:采用微量稀釋法測駱駝蓬靈和洗必泰(CHG)單獨抗金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物膜的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC);棋盤稀釋法測定兩種藥物聯(lián)合時的協(xié)同效果;以及激光共聚焦采集圖片檢測部分聯(lián)合的效果。結果表明,駱駝蓬靈和CHG聯(lián)合具有協(xié)同抗菌效果。在懸浮菌試驗中,9株顯示抗浮游菌協(xié)同活性,在生物膜試驗中,11株顯示協(xié)同抗生物膜活性。其余菌株顯示相加活性,本試驗中無頡頏作用。初步探索了體外試驗協(xié)同作用的原因,為克服金黃色葡萄球菌耐藥提供了一個可供選擇的方法。

    關鍵詞:駱駝蓬靈;洗必泰;協(xié)同作用;抗菌活性

    中圖分類號:TQ464.4文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2011)16-3346-05

    Antimicrobial Efficacy of Harmaline Alone and in Combination with Chlorhexidine Digluconate against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus Grown in Planktonic and Biofilm Cultures

    SHEN Feng-ge,XING Ming-xun,LIU Li-hui,YUAN Peng,SHI Qi-yun,YU Lu

    (Institute of Zoonosis, Jilin University, Changchun 130062,China)

    Abstract: Minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentrations(MBC) of harmaline and chlorhexidine digluconate (CHG) against clinical isolates of Staphylococcus aureus were determined for each microorganism grown in suspension or biofilm using microbroth dilution method. Chequerboard assays were used to determine synergistic, indifferent or antagonistic interactions between harmaline and CHG; and some of the results were verified by confocal laser scanning microscopy. Harmaline and CHG showed effective antimicrobial activity against suspensions and biofilm cultures of S. aureus. Synergistic antimicrobial effects between harmaline and CHG were observed in 9 and 11 of the 13 S. aureus strains when in suspension and in biofilm, respectively. No antagonistic activity was observed in any of the strains tested. Synergistic activity of harmaline and CHG against clinical isolates of S. aureus (in suspension and in biofilm) were observed in vitro. This study might provide alternative methods to reduce the resistance of S. aureus both in suspension and biofilm.

    Key words: harmaline; chlorhexidine digluconate; synergy; antimicrobial activity

    金黃色葡萄球菌(S. aureus)是革蘭氏陽性菌,是一種重要病原菌,隸屬于葡萄球菌屬,能導致人體的局部和全身感染[1],此外還能導致皮膚感染,食物中毒,關節(jié)炎,肺炎,腦膜炎,脊髓炎,心內膜炎和嚴重的并發(fā)癥[2]。

    金黃色葡萄球菌能產生生物膜,生物膜能將細菌表面粘連在一起,形成復雜的生物群落,這種復雜的生物群落嵌入自身產生的多糖基質中,能抵抗環(huán)境和微生物的威脅[3]。據(jù)報道,微生物因子抗生物膜的最低抑菌濃度(MICs)是懸浮菌的10~1 000倍[4]。因此,急需開發(fā)新的藥物去治療金黃色葡萄球菌的生物膜感染。

    洗必泰(CHG)是一種很普遍的抗微生物因子,在臨床實踐中用于皮膚的消毒。洗必泰(CHG)具有很寬的抗菌譜,可抗多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌,如金黃色葡萄球菌[5]。盡管CHG具有抗微生物活性,但是它的水和含醇制劑對皮膚的穿透力很弱,而細菌能在皮膚的深層存活[6]。因此,開發(fā)有效的和迅速穿透皮膚深層的消毒劑是很必要的,以預防侵入相關的皮膚感染[7]。

    植物和其他的天然物質是新的抗微生物因子或協(xié)作劑的有效資源[8]。研究顯示其對耐藥的菌株有較寬的抗菌譜[9]。駱駝蓬靈是一種生物堿,是駱駝蓬(Peganum harmala)種子提取物的主要成分,很多體外研究顯示它具有抗菌活性[10]。研究表明,這種生物堿具有抗細菌、抗腫瘤、抗血孢子蟲、抗癌、抗血管舒張和抗原蟲的作用[11,12]。目前尚未發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈對金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物膜的活性影響的相關報道。

    本試驗應用了微量稀釋法和棋盤法調查駱駝蓬靈單獨和與洗必泰聯(lián)合抗金黃色葡萄球菌的活性。

    1材料和方法

    1.1材料

    甘果紅瓊脂:0.08 g甘果紅(Hopkins and Williams Ltd,Essex,UK),5 g蔗糖(Fisher Scientific, Leicestershire,UK)和1 g瓊脂粉(Oxoid,Basingstoke,UK)與98 mL腦心浸液(Oxoid)混合制得,高壓滅菌,備用。Mueller-Hinton agar (MHA) and Mueller-Hinton broth(MHB) (Oxoid,Basingstoke,UK)按說明書配制,高壓滅菌,備用。20%的洗必泰(CHG)和駱駝蓬靈均購自美國 Sigma 公司。葡萄糖購自于Fisher Scientific。磷酸緩沖鹽水(PBS)按說明書配置。96孔、6孔板及玻片購自于Nest Biotech.Ltd。

    1.2菌株

    12株臨床分離株從吉林大學第一附屬醫(yī)院分離得到,ATCC 29213購自于中國醫(yī)學微生物菌種保藏中心(National Center for Medical Culture Collection)(CMCC)。細菌在MHB或MHA(Oxoid, Basingstoke, UK)上37 ℃培養(yǎng)。

    1.3藥物準備

    駱駝蓬靈用含0.1 mol/L H2SO4的去離子水配成20 480 μg/mL,-70 ℃儲存。CHG用MHB稀釋成512 μg/mL,備用。

    1.4細菌懸液的準備

    菌株在MHA板培養(yǎng),37 ℃過夜。挑單菌落與MHB中搖床過夜,OD660nm 0.1(約108 CFU/mL)。接種物在MHB中稀釋,使菌液的濃度到106 CFU/mL。

    1.5懸浮菌的微量稀釋法藥物敏感試驗

    CHG和駱駝蓬靈的最低抑菌濃度(MIC)通過倍比稀釋法按CLSI原則[13]測得。在96孔板中用MHB將抗菌藥物做倍比稀釋,得到100 μL的一系列藥液。每孔加入稀釋好的抗菌藥物100 μL,每孔含菌1×105CFU;只加培養(yǎng)基的為對照孔;將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)24 h。肉眼未見細菌生長的最低藥物濃度即為該藥的最低抑菌濃度(MIC)。所有抑菌的孔中取適量液體按原來的次序涂于MH瓊脂板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,肉眼未見細菌生長的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)。試驗重復3次。

    1.6懸浮菌的棋盤測定試驗

    CHG與駱駝蓬靈間的協(xié)同作用是經微量棋盤測定法測定的[14]。?。担?μL用MHB倍比稀釋的駱駝蓬靈(1/32×MIC~4×MIC)加于96孔板的橫行,50 μL CHG的濃度梯度依次從1/256×MIC到4×MIC加于豎列。在孔中加入100 μL濃度為106 CFU/mL的菌液。第12列作為對照,每孔分別加200 μL MHB或100 μL 106CFU/mL 的菌液和100 μL培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h。通過計算分級抑制濃度指數(shù)(FICI)來評價藥物抗菌作用[15]。FICI=(MICa聯(lián)合/MICa單藥)+(MICb聯(lián)合/MICb單藥)。FICI≤0.5為協(xié)同;FICI>4.0為頡頏;0.5<FICI≤4為相加。試驗重復2次。

    1.7生物膜的建立

    取能形成生物膜的菌株液200 μL,濃度為1×105 CFU/mL,加于96孔板,37 ℃培養(yǎng)48 h。

    1.8生物膜的微量稀釋藥敏試驗

    棄去形成生物膜的96孔板中的懸液,用250 μL PBS洗去懸浮的殘余菌液。用MHB倍比稀釋的CHG和駱駝蓬靈。200 μL藥物稀釋液按順序加入各孔,對照孔只加PBS液200 μL。37 ℃培養(yǎng)24 h。棄去懸液,用PBS洗一次,加入250 μL PBS,50 Hz超聲波震蕩30 min,每孔的250 μL液體分別涂于MHA上,制備生物膜[16],37 ℃培養(yǎng)24 h。肉眼可見與對照孔菌量一樣或少于對照孔(加PBS的孔)的最低藥物濃度為最小抑制膜生長的濃度(MBIC),未見細菌生長的最小藥物濃度為最小殺生物膜濃度(MBBC)。試驗重復3次。

    1.9生物膜的棋盤測定試驗

    形成生物膜后,按上述方法用PBS洗1次,分別?。保埃?μL CHG(1/256×MIC~4×MIC)和駱駝蓬靈(1/16×MIC~4×MIC)稀釋液加于96孔板中,CHG加到豎列孔中,駱駝蓬靈加到橫行。37 ℃培養(yǎng)24 h。棄去藥液后再用PBS洗1次,用以前描述的方法得到生物膜,每孔250 μL涂到MHA上,37 ℃ 24 h培養(yǎng)后,評估FICI值。

    1.10激光共聚焦(CLSM)

    通過激光共聚焦攝像驗證CHG和駱駝蓬靈單獨和聯(lián)合后的活性。2 mL菌液加于6孔板的含有滅菌玻片的各孔中,培養(yǎng)48 h,形成生物膜。玻片用PBS洗一次,將玻片移入含受試條件的藥液中,培養(yǎng)24 h。然后用PBS洗,用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability kit(Invitrogen Molecular Probes, Eugene,OR,USA)的說明書進行染色。用 Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)a×60 物鏡采集圖像.。采用Fluoview version 1.7.3.0.分析圖像和輸出圖像。

    2結果

    2.1CHG和駱駝蓬靈對抗懸浮菌和生物膜的微量藥敏試驗

    筆者對12株臨床分離株和1株質控株ATCC 29213進行了調查,CHG和駱駝蓬靈單獨對抗金黃色葡萄球菌的懸浮菌和生物膜的活性,見表1。

    2.2CHG和駱駝蓬靈對抗懸浮菌和生物膜的棋盤試驗

    在懸浮菌中CHG聯(lián)合駱駝蓬靈的抗菌活性,見表2。結果顯示,在受試的懸浮菌中有9株具有協(xié)同作用,其FICI值0.375~0.500;4株有相加作用,其FICI值0.750~1.500。

    在對抗生物膜的試驗中,受試的13株金黃色葡萄球菌中11株具有協(xié)同活性,FICI值為0.250~0.500。S. aureus 3629和S. aureus 3218顯示了相加的抗菌活性,其FICI值分別是0.750和1.500(表3)。在所有試驗中均未出現(xiàn)頡頏作用。

    2.3激光共聚焦試驗

    通過激光共聚焦試驗評估CHG和駱駝蓬靈單獨和聯(lián)合抗生物膜活性(圖1)。處理24 h后對照組可見大量的活菌生長(圖1-E),與對照相比,4×MIC駱駝蓬靈處理后可見大量的細菌死亡,僅留部分菌在玻片上(圖1-C),4×MIC CHG處理后與之相似,可見大量的細菌死亡(圖1-A)。用CHG和駱駝蓬靈聯(lián)合處理后,圖片顯示出極強的殺菌效果,僅有少量的菌存活(圖1-F)。

    4討論

    在本研究中,我們用棋盤稀釋法初步分析了藥物-藥物相互作用。我們發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈抗金黃色葡萄球菌的活性較弱,但與CHG聯(lián)合時具有較好的協(xié)同效果。據(jù)報道發(fā)現(xiàn)桉樹油和CHG具有較好抗金黃色葡萄球菌生物膜活性[17],這與我們的結果一致。此外,有報道發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈具有毒性,但是其毒性很低[18]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)生物膜能增加了藥物的耐藥性[19]。同時,CHG和駱駝蓬靈對抗生物膜時有較高的MBCs值(≥512 μg/mL)。

    在本研究中,駱駝蓬靈聯(lián)合CHG抗受試的金黃色葡萄球菌的懸浮菌和生物膜均具協(xié)同效果。此外,在抗生物膜的試驗中,結果顯示二者聯(lián)合使用具有協(xié)同的作用,僅在S. aureus 3629和S. aureus 3218表現(xiàn)出相加的效果。重要的是,我們對棋盤稀釋法測得的結果用CLSM進行了進一步的證實。CLSM的圖像顯示駱駝蓬靈不僅能強有力地殺死細菌,而且也能很好地清除生物膜(圖1-D)。與之相似的是,高濃度的CHG能有效地清除生物膜,但是它的殺菌作用較弱(圖1-B)。

    在臨床中,CHG廣泛被用于皮膚消毒。CHG具有親水和疏水基因,研究表明生物膜的細胞外基質所帶的陰離子阻礙了CHG陽離子的擴散,且能使細胞外基質的理化性質和三級結構改變[5]。二氫駱駝蓬堿和駱駝蓬靈是駱駝蓬種子提取物的主要生物堿,它用于控制自熱感染和實驗感染的牛血孢子蟲[20]。也有研究表明駱駝蓬靈氨基氧化酶抑制子是一個Na+/Ca2+交換的弱的抑制子[21],它對NHE(Na+/H+交換)亞型顯示出不同的親和力[22]。我們發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈與CHG聯(lián)合時在受試多數(shù)菌株中表現(xiàn)協(xié)同活性。此外,當駱駝蓬靈和CHG聯(lián)合時能導致生物膜的結構破壞和細菌的死亡。駱駝蓬靈對抗金黃色葡萄球菌生物膜的機制目前尚不清楚。

    綜上所述,盡管駱駝蓬靈單獨使用時的抗菌活性較弱,但與CHG聯(lián)合對抗黃色葡萄球菌分離株和質控株ATCC 29213有潛在協(xié)同活性。該發(fā)現(xiàn)具有一定的臨床價值。同時,對開發(fā)新型抗耐藥金黃色葡萄球菌藥物具有重要價值。

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