樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分研究

劉英杰，李雨婷，蘇 玲，宋 慧，薛 強

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118;2.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

樹舌靈芝［Ganoderma lipsiense(Batsch)G.F.Atk.，Syn.G.applanatum(Pers.)Pat.;Elfvingia applanata(Pers.)Karst.］為靈芝科(Ganodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma Karst.)高等真菌。迄今為止，已從樹舌靈芝子實體中分離得到糖類［1］、甾體化合物［2］、三萜類［3］、脂類［4］、有機酸、生物堿類、氨基酸、多肽、酚類、內(nèi)酯、香豆素類、苷類和揮發(fā)油以及微量元素等物質(zhì)［5］，多種化學(xué)成分使其具有廣泛的生物活性。

液體深層發(fā)酵是目前工廠化生產(chǎn)藥用真菌的主要手段，目前，尚未見對樹舌靈芝發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分研究的報道。鑒于此，本研究以工業(yè)化生產(chǎn)的樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體為材料，對其化學(xué)成分進行系統(tǒng)研究，以便更好地開發(fā)這一藥用真菌資源。

1 材料

樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體由白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠提供。

Agilent 6010紫外分光光度計(安捷倫);紅外分光光度計FTIR-8400s(島津);Varian INOVA-400型核磁共振波譜儀。

2 方法

樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體粉末用95%乙醇50℃回流24 h，過濾，重復(fù)三次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液置于冰箱中靜止24 h，離心，獲得沉淀和上清液。所得的沉淀和上清液通過硅膠柱層析和大孔吸附樹脂層析進行進一步分離，最后獲得單體化合物。具體流程見圖1。

圖1 樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分提取分離流程圖Fig.1 Extraction and isolation of the compounds from submerged fermentation mycelium of Ganoderma lipsiense

3 結(jié)果

3.1 化合物A

白色針狀晶體，易溶于氯仿等有機溶劑，不溶于水。熔點156～159℃，TLC(薄層色譜)展開后碘顯色，呈黃棕色斑點，噴灑5%乙醇濃硫酸顯紫色斑點。

紅外光譜中，2 957 cm－1為=C-H伸縮振動，2 871 cm－1為飽和C-H伸縮振動吸收，1 657和1 460 cm－1為共軛雙鍵C=C伸縮振動，1 373 cm－1為甲基C-H對稱彎曲振動。

13C-NMR波譜給出了27個碳原子信號，13CNMR(CDC3)中 δ141.32，139.77，135.56，131.98，119.58，116.29 提示分子中有三個雙鍵。1H-NMR(CDCl3)顯示有四個烯氫信號:δ5.574(1H，dd，J=5.5，2.8 Hz)，5.384(1H，ddd，J=5.5，2.8，2.5 Hz)，5.220(1H，dd，J=15.3，7.4 Hz)，5.172(1H，dd，J=15.3，8.3 Hz)。δ5.220 與5.172 氫有一個同樣的偶合常數(shù)15.3 Hz，大于12 Hz，說明這是雙鍵的兩個反式氫，而另一對偶合常數(shù)分別是7.4 Hz和8.3 Hz，說明這個雙鍵處于側(cè)鏈上。1H-NMR譜中δ3.636(1H，m)為甾醇的三位α 氫信號。δ1.029(3H，d，J=6.6 Hz)，0.948(3H，s)，0.910(3H，d，J=6.9 Hz)，0.833(3H，d，J=6.8 Hz)，0.799(3H，d，J=6.6 Hz)，0.632(3H，s)提示分子中有 6 個甲基。其波譜數(shù)據(jù)與文獻［6］中報道的麥角甾醇基本一致，故將該化合物定為麥角甾醇。

3.2 化合物C

無色針狀晶體，易溶于水，微溶于甲醇，不溶于有機溶劑，熔點166～168℃，Molish反應(yīng)呈陽性。取本品飽和水溶液少許，加入三氯化鐵試液與氫氧化鈉試液，即生成棕黃色沉淀，震搖不消失;滴加過量的氫氧化鈉試液，既溶解成棕色溶液。

紅外光譜在3 400，3 288 cm－1有締合羥基存在，2 985 cm－1有-CH2-對稱伸縮振動，1 420 cm－1有-CH-面內(nèi)彎曲振動，1 282 cm－1有-OH基團面內(nèi)彎曲振動，1 081 cm－1有仲醇 C-O 伸縮振動，1 020 cm－1有伯醇C-O伸縮振動，631 cm－1有-CH-面外彎曲振動。

1H-NMR 圖譜化學(xué)位移 δ=2.495、δ=2.500、δ=2.504、δ=3.312、δ=3.362、δ=3.376、δ=3.389、δ=3.403、δ=3.446、δ=3.460、δ=3.468、δ=3.532、δ=3.542、δ=3.561、δ=3.595、δ=3.603、δ=4.111、δ=4.128、δ=4.289、δ=4.303、δ=4.317、δ=4.384、δ=4.398。紅外光譜與1H-NMR圖譜通過與甘露醇對照品圖譜相對照，結(jié)合化學(xué)檢測確定該化合物為甘露醇。

3.3 化合物D

易溶于水，微溶于甲醇，不溶于有機溶劑，熔點120～123℃，Molish反應(yīng)呈陽性。

紫外光譜掃描，吸收峰在210 nm波長附近，近紫外區(qū)無吸收，紅外光譜在3 263.63 cm－1有一強特征吸收，符合碳水化合物中的-OH基在3 800～3 200 cm－1之間的伸縮振動。化合物D紅外圖譜的OH基團的特征吸收譜帶強而寬。

1H-NMR 化學(xué)位移:δ=1.136、δ=1.153、δ=1.170、δ=3.325、δ=3.592、δ=3.620、δ=3.647、δ=3.733、δ=3.760。1H-NMR 化學(xué)位移:δ1=3.522(1H d J=4.8 Hz)、δ2=3.541(1H d J=3.6 Hz)、δ3=3.580(1H d J=4.8 Hz)、δ4=3.665(1H s)、δ1=3.684(1H s)。從分析化學(xué)手冊［7］可知，脂肪醇烷基H的化學(xué)位移:連有OH基團的C上的Hδ=3.39～3.94，其中-CH2OHδ=3.59，-CHOHδ=3.94，五元環(huán)中H-C-C-H的偶合常數(shù)J(1.2±5.1)。

13C-NMR 化學(xué)位移:δ=64.325、δ=73.630。根據(jù)13C-NMR譜圖中只有兩個化學(xué)位移峰，結(jié)合紅外光譜推斷化合物C含有4碳4羥基的具有對稱結(jié)構(gòu)的赤蘚糖醇。

3.4 化合物E

白色針狀晶體，易溶于氯仿等有機溶劑，不溶于水。熔點156～159℃，TLC展開后碘顯色，呈黃棕色斑點，噴5%乙醇濃硫酸顯紫色斑點。Lieberman-Burchard反應(yīng)呈陽性，Salkowshi反應(yīng)呈陽性，提示該化合物為甾醇類化合物。

與化合物A的TLC比較，二者在三種不同系統(tǒng)展開劑:氯仿-甲醇(8∶1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(3∶2)和苯-丙酮(7∶2)中 Rf值都相同，分別為0.41，0.44 和0.47。

與化合物A的1H-NMR和13C-NMR波譜譜圖比較，數(shù)據(jù)基本吻合，因此確定化合物E與化合物A相同，為麥角甾醇。

4 討論

赤蘚糖醇為首次從樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中被分離得到，在樹舌靈芝子實體中也未見報道，由于其具有重要的藥理活性及化工用途［8-11］，本研究所得結(jié)果對樹舌靈芝菌絲體的開發(fā)應(yīng)用具有重要的意義。但是，研究未涉及對赤蘚糖醇的提取工藝及樹舌靈芝液體深層發(fā)酵條件的研究，今后可開展相關(guān)工作為樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體的應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。

本研究中，在兩種分離途徑中都分離獲得了麥角甾醇單體化合物A和E，而且化合物A的分離方法更簡單、易操作。根據(jù)麥角甾醇的理化性質(zhì)，采用高溫提取，低溫、低醇的分離方法對其進行分離，是快速提取麥角甾醇的可行方法。

本研究表明通過吸附樹脂色譜結(jié)合TLC、薄層制備的方法可獲得甘露醇晶體，但是在薄層制備的過程中由于色譜時間較長，增加了分離的時間，若在純化的過程中結(jié)合現(xiàn)代分析制備儀器將能更快地獲得甘露醇的晶體。

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