納米銀生物海綿的制備及抗菌性能

李東紅，刁俊林，劉建倉，胥 婷

(創(chuàng)傷、燒傷、復(fù)合傷國家重點實驗室，第三軍醫(yī)大學 大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室，重慶 400042)

為提高敷料的抗菌性能，人們進行了大量的嘗試，研究發(fā)現(xiàn)銀原子具有一定的殺菌能力，尤其是當被制成納米級的顆粒后，由于其比表面積大幅提高，表面原子所占比例增大，其殺菌活性也相應(yīng)提高［1-4］。由于納米銀的這些特點，納米銀敷料的研制受到人們的關(guān)注。如姜會慶等［5］將納米銀材料種植附著在棉紗纖維上制得一種納米銀敷料，用于治療燒傷創(chuàng)面及久治不愈的褥瘡收到了良好效果。本文報道了一種載納米銀生物海綿的制備方法及其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制能力，為其作為新型抗菌生物敷料用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料

殼聚糖(臺州康多海洋生物醫(yī)藥化工有限公司);海藻酸鈉、戊二醛、硝酸銀(國藥集團上海化學試劑有限公司);膠原蛋白(北京嘉康源化學試劑有限公司);可吸收性明膠海綿(南京金陵制藥廠);水解酪蛋白瓊脂板(溫州市康泰生物科技有限公司)。

金黃色葡萄球菌(ATCC25922)、大腸埃希菌(ATCC25923)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)均由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院檢驗科提供。

SD大鼠，STF級，雌雄不拘，體重200～225 g，由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(渝)2007-0005。

2 方法

2.1 生物海綿及納米銀生物海綿的制備

將一定比例的殼聚糖、海藻酸鈉和膠原蛋白混合膠液用戊二醛交聯(lián)，冷凍干燥后得生物海綿;將一定量的硝酸銀溶液加入一定比例的殼聚糖、海藻酸鈉和膠原蛋白的混合膠液中，戊二醛交聯(lián)，冷凍干燥，100℃烘烤4 h，紫外線照射2 h后形成納米銀生物海綿。

2.2 納米銀粒徑的測定

樣品表面鍍金后，用場發(fā)射掃描電鏡(FEI NOVA nano SEM 400)對該納米銀生物海綿表面納米銀的粒徑進行分析(加速電壓:10 kV;工作距離:5.0 mm)。

2.3 體外抑菌效果的測定

將生物海綿、納米銀生物海綿和可吸收性明膠海綿搟壓成薄片，裁剪成直徑為6 mm的圓片，紫外線照射殺菌。將細菌配制成1.5×108個/mL的菌液，用滅菌后的棉拭子蘸取菌液，反復(fù)、均勻地涂布于整個水解酪蛋白瓊脂板上，用鑷子取海綿平貼在平板表面，37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，用游標尺測量抑菌圈大小。

2.4 在體抑菌效果的測定

將30只SD大鼠背部作為致傷部位，傷前1 d用8%Na2S去毛。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠俯臥固定于手術(shù)臺上，背部用碘酒和75%酒精消毒，于正中剪去大約1.5cm×1.5 cm的皮膚(深至肉膜)制成受傷創(chuàng)面，用無菌棉拭子擦去血液后，在創(chuàng)面涂抹金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的混合菌液(混合前，各菌液均為1.0麥氏濃度)，然后在創(chuàng)面上覆蓋受試海綿，再以無菌脫脂紗布覆蓋海綿，包扎固定。隨機分成兩個組，可吸收性明膠海綿組和納米銀生物海綿組，每組各15只大鼠，分別于致傷后1，2，3，7和14 d開啟敷料(中途如有敷料脫落，及時更換)，觀察創(chuàng)面的大體情況，少量生理鹽水沖洗創(chuàng)面后，用無菌棉拭子擦刮痂下組織滲液，作細菌培養(yǎng)，鑒定細菌的種屬和數(shù)量。

3 結(jié)果

3.1 海綿中納米銀的粒徑

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在生物海綿表面彌散分布有納米銀顆粒，呈球形，顆粒尺寸大小不一，分布范圍為20～80 nm，但大約85%的納米銀顆粒的粒徑為40 nm，結(jié)果見圖1。

圖1 載納米銀生物海綿SEM圖Fig.1 SEM of bio-sponge loading Ag nanoparticle

3.2 體外抗菌實驗結(jié)果

如圖2所示，可吸收性明膠海綿和生物海綿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌三個菌種都沒有產(chǎn)生抑菌圈，而納米銀生物海綿對三個菌種都有一定的抑制作用，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力稍弱一點，可產(chǎn)生10～11 mm的抑菌圈(包括海綿的直徑)，而對銅綠假單胞菌的抑制作用明顯，可產(chǎn)生13～14 mm的抑菌圈。且納米銀生物海綿抑菌能力與納米銀的含量有一定關(guān)系，當硝酸銀含量小于3.8%，抑菌效果不明顯(照片未顯示)，但當硝酸銀的含量大于7.6%后再增加硝酸銀的含量并不能明顯增強其抑菌能力。

圖2 體外抑菌實驗結(jié)果Fig.2 Results of anti-bacteria in vitro

3.3 傷口的大體觀察及細菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果

明膠海綿組在細菌感染后的前3 d，大鼠背部傷口有明顯膿斑，1周后傷口痂下可見明顯新生肉芽組織，但傷口仍有小量膿斑，2周后大鼠傷口愈合良好，痂面縮小到原傷口的1/2～1/3;載納米銀海綿組在細菌感染后的第3天，大鼠背部也可見膿斑，但較明膠海綿組少，1周后傷口痂下可見明顯新生肉芽組織，已無膿斑，2周后大鼠傷口愈合良好，痂面縮小到原傷口的1/2～1/3，與明膠海綿組比較無明顯差別。細菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果見表1。在感染后的第1天，明膠海綿組檢測到大量的銅綠假單胞菌和中量的金黃色葡萄球菌，而載納米銀海綿組只檢測到少量的銅綠假單胞菌和中量的金黃色葡萄球菌;在隨后各時間點，明膠海綿組檢測到的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均明顯多于載納米銀海綿組，到第2周，載納米銀海綿組已基本檢測不到細菌，但明膠海綿組仍可以檢測到少量細菌。但兩組在各時相點均沒有檢測到大腸桿菌。

表1 海綿的在體抑菌實驗結(jié)果Tab.1 Results of anti-bacteria of sponge in vivo

4 討論

在因創(chuàng)傷、擦傷、燒傷及潰爛等而導致皮膚傷害后，很容易造成細菌感染、體液流失并引起各種并發(fā)癥。因此，創(chuàng)面感染一直是平戰(zhàn)時創(chuàng)傷、燒傷等治療中面臨的重要課題［6］。在治療這種有組織損失的人體皮膚損傷時，通常采用敷料對傷口進行保護，防止傷口的感染和脫水，在傷口處維持有利于治療的潮濕環(huán)境，改善治療效果，促進傷口愈合。理想敷料應(yīng)具備如下特征［7］:(1)安全無毒，無刺激性;(2)良好的生物相容性和可降解性;(3)可保持創(chuàng)面的濕潤環(huán)境，具較好的吸收能力和一定的透氣性;(4)阻止細菌侵入，抑制細菌生長;(5)最好有止血、止痛等作用，可促進肉芽生長和皮膚再生，加速愈合，減少疤痕;(6)貯存穩(wěn)定性好。目前還沒有敷料能完全達到這些要求。

現(xiàn)臨床上使用最多的敷料還是紗布。這種惰性敷料，雖然具有吸收性好、保護創(chuàng)面、制作簡單、價格便宜等優(yōu)點，但由于其無法保持創(chuàng)面濕潤、易與傷口粘連、不能阻止細菌入侵等缺點，因而對傷口的感染和化膿無能為力，對創(chuàng)面的愈合無明顯促進作用，在換藥時還會造成對新生組織的再次損傷，增加病人的痛苦。為了克服傳統(tǒng)紗布敷料的不足，許多生物敷料如可吸收性明膠海綿、膠原蛋白海綿等應(yīng)運而生。這些生物載藥敷料由于其獨特的性能，如良好的組織相容性和可降解性、安全低毒、在保護創(chuàng)面的同時還能有效地治療傷口，促進組織修復(fù)等而倍受人們的關(guān)注。

為了改善敷料的性能，人們通過在敷料中載入不同的抗生素［8-9］、單質(zhì)碘［10］等來提升敷料的抑菌能力，但由于許多菌種對抗生素產(chǎn)生了耐藥性，而碘不穩(wěn)定，易升華，使這類敷料的應(yīng)用受到限制。單質(zhì)銀具有廣譜殺菌能力，特別是在制備成納米級的顆粒后。且銀的殺菌機制不同于化學合成的抗菌劑，主要是基于重金屬離子對細菌蛋白質(zhì)的變性作用，因而具有廣譜殺菌及很少產(chǎn)生耐藥菌的特點［11］。

納米銀的制備方法有多種，本文采用簡單實用的射線輻照法［12］，通過紫外線照射含硝酸銀的生物海綿得到了載有納米銀的生物海綿。經(jīng)SEM測試，證實銀顆粒的粒徑主要為40 nm。

在體外抑菌試驗中，我們發(fā)現(xiàn)，納米銀生物海綿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌都有一定的抑制作用，尤其是對銅綠假單胞菌，而可吸收性明膠海綿和未載納米銀生物海綿對三個菌種都沒有產(chǎn)生抑菌圈。殼聚糖的抑菌作用已有文獻報道［13-15］，生物海綿中的主要成分為殼聚糖，沒有觀察到生物海綿的抑菌作用可能與殼聚糖的抑菌機理有關(guān)。文獻報道的殼聚糖抑菌研究都是在液態(tài)中測定的，在酸性條件下，殼聚糖分子中的質(zhì)子化銨具有正電性，可吸附帶有負電荷的細菌，使細菌細胞壁和細胞膜上的負電荷分布不均，干擾細胞壁的合成，破壞細胞膜的功能，使細胞膜因不能承受滲透壓而變形破裂，發(fā)生細菌溶解而亡［16］。但在我們的試驗條件，生物海綿中的殼聚糖處于中性的固體狀態(tài)，因而很難實現(xiàn)它的抑菌作用。另外，在交聯(lián)過程中，殼聚糖分子中的氨基很可能與戊二醛發(fā)生反應(yīng)，而殼聚糖分子中氨基上的反應(yīng)也會改變殼聚糖的抑菌性能［17］。由此可見，載納米銀生物海綿產(chǎn)生的抑菌作用應(yīng)歸功于海綿表面上的納米銀顆粒。

在體抑菌實驗結(jié)果也進一步印證了載納米銀海綿對細菌，尤其是銅綠假單胞菌的抑制能力。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，在各時相點，兩組均沒有檢測到大腸桿菌。據(jù)報道［18-20］，某些銅綠假單胞菌菌株能夠產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，對其他菌種的生長產(chǎn)生抑制和滅殺作用，因此，我們認為沒有檢測到大腸桿菌可能歸因于銅綠假單胞菌對大腸桿菌的滅殺作用。

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