銀翹解毒液超快速液相色譜指紋圖譜研究

王延博，孫佳明，李 娜，李 航，張 輝

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 1.現(xiàn)代教育技術(shù)中心，2.中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117)

銀翹解毒口服液系由銀翹解毒丸等藥典收載品種改制而來，制劑處方由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹葉、甘草等組成，具有疏風(fēng)解表，清熱解毒的功效，用于風(fēng)熱感冒，癥見發(fā)熱頭痛，咳嗽口于，咽喉疼痛［1］。文獻(xiàn)多采用測(cè)定處方中的君藥中的有效成分綠原酸的含量，來評(píng)價(jià)其質(zhì)量?jī)?yōu)劣［2-3］。建立全面、系統(tǒng)地控制銀翹解毒液質(zhì)量的分析方法十分必要。本文采用二元梯度洗脫模式，建立了完整的銀翹解毒液超快速液相色譜(UFLC)指紋圖譜分析和評(píng)價(jià)質(zhì)量的方法，并對(duì)不同批次銀翹解毒液的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其整體控制和評(píng)價(jià)內(nèi)在質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

UFLC-20AD超快速液相色譜儀、PAD檢測(cè)器MB20A、LCsolution色譜工作站，日本島津公司。

綠原酸對(duì)照品(批號(hào):753-201010，供含量測(cè)定用)，中國(guó)藥品生物制品鑒定所;銀翹解毒液(批號(hào):100521，100625，100712，100728，100815，100821，109014，100918，101021，101025)，哈藥集團(tuán)中藥二廠;甲醇(色譜純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取銀翹解毒液10mL，60℃減壓蒸干，精密稱取粉末 30.0mg，加50%甲醇 12mL，超聲 30 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取綠原酸對(duì)照品適量，用50%甲醇溶解，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB C18(100 mm×4.6 mm，2.2μm)。流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相 B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫:0～10 min，A相保持10%;10～20 min A相10%→15%;20～25 min，A相15%→25%;25～30 min，A 相 25%→33%;30～40 min，A相保持33%;40～50 min，A相33%→45%。流速為0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10μL。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品(批號(hào)100521)溶液，分別在0，2，4，8，12 h進(jìn)行檢測(cè)，考察各主要色譜峰與內(nèi)參峰保留時(shí)間的一致性，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，各主要色譜峰的相對(duì)峰面積比值的RSD不超過5%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 精密度試驗(yàn)

取供試品(批號(hào)100521)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察各主要色譜峰與內(nèi)參峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)面積的一致性，結(jié)果各主要峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值的RSD不超過5%，表明進(jìn)樣與儀器的精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取供試品(批號(hào)100521)3份，同法檢測(cè)，考察各主要色譜峰與內(nèi)參比峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)面積的一致性，結(jié)果各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值的RSD不超過5%，表明方法重復(fù)性較好。

2.7 UFLC指紋圖譜的建立

按2.2項(xiàng)方法制備樣品，在2.3項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)10批銀翹解毒液的UFLC色譜圖進(jìn)行了分析，確定了16個(gè)共有峰(見圖1～2)，建立了銀翹解毒液的UFLC指紋圖譜。以綠原酸(峰5)作為參照物，其保留時(shí)間和峰面積分別定為1.00，16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(10批樣品±s)分別為0.408±0.002，0.525± 0.001，0.603± 0.001，0.873±0.001，1，1.293± 0.001，1.695± 0.002，2.022±0.003，2.039± 0.003，2.097± 0.005，2.164±0.008，2.701± 0.024，2.781± 0.023，2.845±0.020，2.933± 0.022，3.004± 0.020;相對(duì)峰面積(10批樣品，±s)分別為1.200±0.027，0.120±0.004，0.231± 0.007，0.055± 0.005，1，0.903±0.018，1.972± 0.092，0.221± 0.015，0.202±0.020，0.500± 0.009，0.095± 0.004，4.387±0.068，0.158± 0.014，0.290± 0.013，0.522±0.011，0.050±0.003。

圖1 銀翹解毒液UFLC對(duì)照指紋圖譜Fig.1 UFLC reference fingerprint of the Yinqiao Jiedu Oral Liquid

圖2 綠原酸對(duì)照品UFLC圖Fig.2 UFLCfingerprint of chlorogenic acid

2.8 UFLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

將10個(gè)不同批次的銀翹解毒液制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄UFLC色譜圖(圖3)，并將圖譜用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版1.0版》軟件進(jìn)行處理，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜［4］。10批銀翹解毒液的UFLC色譜圖的相似度分別為0.953，0.983，0.972，0.959，0.987，0.945，0.991，0.995，0.942 和0.962，均大于0.9，基本符合中國(guó)藥典中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，所建立的銀翹解毒液UFLC對(duì)照指紋圖譜可作為銀翹解毒液的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

3 討論

目前對(duì)于銀翹解毒液的含量測(cè)定主要集中在HPLC法測(cè)定綠原酸，但其分析時(shí)間長(zhǎng)，分離效果差。UFLC是日本島津公司近幾年推出的新型液相色譜儀，其采用特殊技術(shù)，使得分析時(shí)間大為縮短，可以有效的節(jié)省溶劑量［5］。

經(jīng)多次摸索，以梯度洗脫模式50 min內(nèi)獲得銀翹解毒液指紋圖譜，圖譜指紋性強(qiáng)，且各色譜峰大部分都得到了基線分離。

采用二極管陣列檢測(cè)器做全波長(zhǎng)掃描，考察不同吸收波長(zhǎng)圖譜，重點(diǎn)考察了210，230，254，280和330 nm處的譜圖特征。結(jié)果表明280 nm波長(zhǎng)處各成分具有較好的紫外吸收，色譜信息最為豐富，基線平穩(wěn)。

實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)其甲醇、含水甲醇和水的提取物分別進(jìn)行考察，結(jié)果50%甲醇提取物出峰較好，故實(shí)驗(yàn)中樣品均采用50%甲醇提取。同時(shí)提取時(shí)對(duì)樣品分別超聲處理和加熱回流處理，結(jié)果表明，以50%甲醇超聲提取，出峰最好，色素干擾少，故實(shí)驗(yàn)中采用口服液蒸干后取適量50%甲醇超聲30 min。

目前對(duì)于銀翹解毒液的質(zhì)量控制，主要針對(duì)綠原酸和連翹苷的含量，不能全面反映銀翹解毒液的質(zhì)量，本文建立了銀翹解毒液UFLC指紋圖譜的檢測(cè)方法，得到的指紋圖譜各色譜峰分離度較好，且該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為銀翹解毒液的全面質(zhì)量控制提供參考。

圖3 10批銀翹解毒液的UFLC指紋圖譜(檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm)Fig.3 UFLC reference fingerprint of 10 batchs Yinqiao Jiedu Oral Liquid(wavelength:280 nm)

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2010:1086.

［2］湛文青，李 虹.HPLC法測(cè)定銀翹解毒液中綠原酸含量［J］.廣東藥學(xué)，2004，14(1):11-13.

［3］鐘鏡金，陳豐連，王術(shù)玲，等.HPLC法測(cè)定銀翹解毒口服液中綠原酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(3):228-229.

［4］王婷婷，陳曉輝，胡慶慶，等.白芷質(zhì)量的HPLC指紋圖譜評(píng)價(jià)方法［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41(8):747-751.

［5］施 法，侯 峰.金銀花中3種成分含量的超高速液相色譜法同時(shí)測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(11):3014-3015.