塞來昔布對宮頸癌細胞的化療增敏作用

周自華 徐寧紅 陳尚忠 鄒 媚 袁志華 肖 麗

COX-2在結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、宮頸癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中均呈高度表達［1～7］。因此，塞來昔布作為1種高選擇性COX-2抑制劑，研究表明，它具有預(yù)防和抑制腫瘤的作用。由于其靶向性強，副作用小，已在多種腫瘤預(yù)防和治療中發(fā)揮作用［8］。本研究主要驗證塞來昔布假設(shè)在無細胞毒作用濃度下，可通過上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白水平，達到增強順鉑對Hela細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細胞株Hela細胞，由南華大學(xué)腫瘤研究所提供。塞來昔布購自安徽合肥森瑞化工有限公司，用95%的乙醇溶解，配成40 mmol/L的儲存液備用。順鉑注射液購自山東齊魯制藥廠，小牛血清購自杭州四季青生物工程公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Amresco公司，鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人Bax抗體均購自Santa公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI-1640，在37℃、飽和濕度、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，每1～2天換液傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測細胞增殖率

取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板，每孔180 μl，含1×104個細胞。培養(yǎng)6 h后每孔加入處理因素，設(shè)調(diào)零組、空白對照組、酒精對照組(含1.75%酒精的RPMI-1640)、塞來昔布組(5、10 μmol/L)、順鉑組(1、2、4 μg/ml)、塞來昔布與順鉑聯(lián)合組(塞來昔布 5、10 μmol/L+順鉑 1、2、4 μg/ml)。每組設(shè) 3 個平行孔，再培養(yǎng)24 h后，加入5 g/LMTT液20 μl/孔(調(diào)零組除外)，再培養(yǎng)4 h，然后吸去上清液，每孔加入100 μl DMSO液，待結(jié)晶完全溶解后，在570 nm波長下測吸光度A值，按下列公式計算藥物對細胞的生長抑制率(IR)。IR=(1－用藥組A值/對照組A值)×100%。聯(lián)合用藥效果根據(jù)文獻［4］提供的金氏公式計算，求出q值進行判斷:q=Ea+b/(Ea+Eb)-Ea×Eb，其中Ea+b為兩藥合用的抑制率，Ea及Eb為各藥單用時的抑制率，當q＜0.85時，表示兩藥合用有拮抗作用;q＞1.15 時，表示兩藥合用有增效作用;1.15≥q≥0.85時，表示兩藥合用有相加作用。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

收集對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)6 h貼壁后，加入含藥物的培養(yǎng)液，分為5組:空白對照組、酒精對照組、塞來昔布組(5 μmol/L)、順鉑組(1、2、4 μg/ml)、塞來昔布與順鉑聯(lián)合組(塞來昔布 5 μmol/L+ 順鉑 1、2、4 μg/ml)。培養(yǎng)24 h后收集細胞，計數(shù)制成1 ml 1×109/L的單細胞懸液。4℃預(yù)冷的70%乙醇2 ml固定細胞，過夜，PBS洗3次后經(jīng)0.5 g/L的 Rnase A消化30 min，應(yīng)用終濃度為65 mg/L的碘化丙啶(propidium iodidu，PI)染色1 h后應(yīng)用流式細胞儀測定，計算細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測蛋白的表達

取對數(shù)生長期的細胞，分為4組:空白對照組、酒精對照組、5 μmol/L 塞來昔布組、10 μmol/L 塞來昔布組。處理24 h后，用PBS洗3次后，加入細胞裂解液，提取蛋白。灌制10%-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加相應(yīng)的一抗，4℃過夜，加二抗，室溫反應(yīng)1 h后洗膜，加發(fā)光劑、壓膜、顯影、定影。采用薄層掃描儀測定膠片印跡區(qū)帶的吸光度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布與順鉑聯(lián)合作用及單用順鉑對Hela細胞增殖的影響

5、10 μmol/L塞來昔布對Hela細胞無明顯毒性作用，增殖抑制率分別為1.25%、2.50%，兩藥合用時細胞生長抑制率均明顯高于相應(yīng)順鉑單藥組，q＞1.15。在順鉑濃度相同條件下，兩藥合用時細胞增殖抑制率隨塞來昔布濃度增加而增高。Hela細胞生長抑制率與塞來昔布、順鉑濃度的關(guān)系見表1。

表1塞來昔布和順鉑對Hela細胞增殖的影響(s，n=3)

表1塞來昔布和順鉑對Hela細胞增殖的影響(s，n=3)

注:a為與空白對照組比較，P＜0.05;b為與相應(yīng)順鉑單藥組比較，P＜0.05

塞來昔布濃度(μmol/L)順鉑0 μ 順鉑 1 μ g/ml IR(%)g/ml IR(%)q 值 順鉑 2 μg/ml IR(%)q 值 順鉑 4 μg/ml IR(%)q 值0 29.61 ±1.76 41.18 ±2.26 47.91 ±2.67 5 0 0.70 ±0.14 35.16 ±3.27(a，b) 1.16 50.64 ±1.95(a，b) 1.22 56.38 ±2.83(a，b) 1.17 10 1.04 ±0.04 41.60 ±1.13(a，b) 1.37 56.97 ±3.65(a，b) 1.35 63.89 ±1.33(a，b)1.31

2.2 塞來昔布單獨及與順鉑合用時對Hela細胞凋亡的影響

Hela細胞的自然凋亡率為 1.18% ±0.07%，5 μmol/L塞來昔布作用于Hela細胞24 h后，細胞凋亡率為1.55% ±0.30%，無顯著性變化(P ＞0.05)，說明5 μmol/L塞來昔布并不能誘導(dǎo)Hela細胞凋亡。不同濃度順鉑(1、2、4 μg/ml)與 Hela細胞作用24 h后，在一定程度上誘導(dǎo)Hela細胞凋亡。兩藥合用時細胞凋亡率均明顯高于相應(yīng)順鉑單藥組(P＜0.05)，見圖1，各順鉑組與塞來昔布(5 μmol/L)聯(lián)合組細胞凋亡率比較見表2。

表2 塞來昔布與順鉑作用Hela細胞24 h后凋亡率情況(s，n=3)

表2 塞來昔布與順鉑作用Hela細胞24 h后凋亡率情況(s，n=3)

注:a為與順鉑組比較，P＜0.05

順鉑濃度(μg/ml)Hela細胞凋亡率(%)順鉑組 順鉑 +5 μmol/L塞來昔布組0 1.18 ±0.07 1.55 ±0.30 a

圖1 流式細胞術(shù)檢測Celecoxib與DDP作用于Hela細胞24 h后凋亡情況

2.3 塞來昔布對Hela細胞相關(guān)蛋白的影響

正常生長的Hela細胞中有Bcl-2、Bax蛋白的表達，酒精對照組與空白對照組上述蛋白表達比較無顯著性差異(P＞0.05)?；叶葤呙鑳x顯示，隨著塞來昔布濃度的增加，Bcl-2蛋白與β-actin的灰度值比逐漸減少，Bax蛋白與β-actin的灰度值比逐漸增大，且呈量效關(guān)系(P ＜0.05)，見表3，圖3。

表3 Western blot檢測目的蛋白分別與β－actin的灰度值比較(s，n=3)

表3 Western blot檢測目的蛋白分別與β－actin的灰度值比較(s，n=3)

注:a為與各空白對照組比較，P＜0.05

塞來昔布(μmol/L)Bcl-2蛋白 Bax蛋白0 2.16 ±0.22 0.83 ±0.17酒精組 2.14 ±0.18 0.85 ±0.15 a

圖2 Westernblot檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達情況

3 討論

宮頸癌的主要治療方法是手術(shù)和放療，作為1種全身治療手段，化療在宮頸癌高危病例和晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的治療中是不可或缺的，可更好的提高局部和遠處轉(zhuǎn)移控制率，提高長期生存率和改善生活質(zhì)量。含鉑類藥物化療已成為局部中晚期宮頸癌的標準治療模式［9］。其中順鉑是被證明在鉑類中最有效的藥物，它是1種廣譜抗癌藥［10］。但順鉑的不良反應(yīng)和腫瘤細胞的耐藥性使宮頸癌的化療效果不理想，因此尋找1種高效的化療增敏劑或本身亦有抗腫瘤活性的藥物倍受關(guān)注。本實驗結(jié)果顯示，單用塞來昔布在0～10 μmol/L的濃度時，對Hela細胞的生長無明顯抑制作用，而聯(lián)用順鉑后，2種藥物聯(lián)合作用組細胞增殖抑制率，都明顯高于相應(yīng)的順鉑單獨用藥組。提示對于上述濃度的順鉑，聯(lián)用塞來昔布能夠發(fā)揮兩者的協(xié)同效應(yīng)，起到化療増敏作用。并且在同一順鉑濃度下，兩藥合用時的增殖抑制率隨塞來昔布濃度增加而增高，但協(xié)同作用的大小與塞來昔布濃度關(guān)系不明顯。順鉑用于宮頸癌化療常規(guī)濃度為50 mg/m2，其血漿峰值濃度為2.5 μg/ml，故本實驗采用與血漿峰值接近的藥物濃度進行研究。不同濃度的順鉑(1、2、4 μg/ml)作用于Hela細胞24h后在一定程度上誘導(dǎo)凋亡，而與塞來昔布(5 μmol/L)合用時，其凋亡率均較相應(yīng)濃度的順鉑單獨用藥組有明顯增高，表明塞來昔布在無細胞毒作用濃度下能增強宮頸癌細胞對順鉑的敏感性，可能成為1種極具潛力的化療增敏藥。

大多數(shù)腫瘤化療藥物是通過誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用的。Bcl-2是凋亡抑制基因，有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2的過度表達與瘤細胞中的耐藥基因的表達相關(guān)聯(lián)，并可通過抑制細胞凋亡而導(dǎo)致耐藥性的發(fā)生［11］。Bax是Bcl-2家族的成員，其作用與Bcl-2相反，是促進細胞凋亡的基因。Bcl-2與Bax在體內(nèi)是通過二聚體而發(fā)揮作用的，Bax/Bcl-2下降，抑制凋亡，Bax/Bcl-2升高，促進凋亡。研究提示COX-2是Bcl-2的上游調(diào)節(jié)成員，它可通過提高Bcl-2的表達，誘導(dǎo)腫瘤組織減少凋亡蛋白Bax表達，降低腫瘤細胞凋亡，從而延長腫瘤細胞生存時間。而選擇性COX-2抑制劑可減少COX-2表達，從而下調(diào)Bcl-2抗凋亡蛋白表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。本組Western blot實驗顯示，經(jīng)塞來昔布處理后，隨著藥物濃度增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減弱，而凋亡蛋白Bax表達增強，使得Bax和Bcl-2比例中，Bax占優(yōu)勢，因而使Bax等蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，并多聚化，形成膜通道，刺激線粒體釋放細胞色素C(CytC)，使CytC釋放進入細胞質(zhì)，通過線粒體/細胞色素 C 途徑發(fā)生凋亡［12，13］。綜上所述，塞來昔布增強Hela細胞對順鉑的敏感性機制之一，也可能是通過調(diào)控這2種蛋白，降低腫瘤細胞的凋亡抗性有關(guān)。

［1］Wendum D，Masliah J，Trugnan G，et al.Cyclooxygenase-2 and its role in colorectal cancer development〔J〕.Virchows Arch，2004，445(4):327.

［2］Khuri FR，Wu H，Lee JJ，et al.Cyclooxygenase-2 overexpression is a marker of poor prognosis in stageⅠnon-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2001，7(4):861.

［3］Uefuji k，Ichikura T，Mochizuki H.Expression of cyclooxygenase-2 in human gastric adenomas and adenocarcinomas〔J〕.J Surg Oncol，2001，76(1):26.

［4］France M，Drew PA，Dodd T，et al.Cyclo-oxygenase-2 expression in esophageal adenocarcinoma as a determinant of clinical outcome following esophagectomy〔J〕.Dis Esophagus，2004，17(2):136.

［5］Visscher DW，Pankratz VS，Santisteban M，et al.Association between cyclooxygenase-2 expression in atypical hyperplasin and risk of breast cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2008，100(6):421.

［6］Fermandina G，Lauriola L，Distefano MG，et al.Increased cyclooxygenase-2 expression is associated with chemotherapy resistance and poor survival in cervical cancer patients〔J〕.J Clin Oncol，2002，20(4):973.

［7］許新華，胡國清，李道俊，等.環(huán)氧化酶-2對鼻咽癌血管生成及預(yù)后的影響〔J〕.中華放射腫瘤學(xué)雜志，2003，12(3):154.

［8］易 芳，許新華.塞來昔布在腫瘤防治中的研究進展〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志，2007，12(4):316.

［9］Shoji T，Takatori E，Murai M，et al.Results of neoadjuvant chemotherapy using tri-weekly CDDP/CPT211 for locally advanced cervical cancer〔J〕.Gan To Kagaku Ryoho，2010，37(4):643.

［10］劉天亮，吳 云.多西紫杉醇聯(lián)合順鉑治療晚期乳腺癌21 例分析〔J〕.中國誤診學(xué)雜志，2008，8(3):707.

［11］Tse C，Shoemaker AR，Adickes J，et al.ABT-263:a potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor〔J〕.Cancer Res，2008，68(9):3421.

［12］Li X，Ding X，Adrian TE.Arsenic trioxide causes redistribution of cell cycle，Caspase activation，and GADD expression in human colonic，breast and pancreatic cancer cells〔J〕.Cancer Invest，2004，22(3):389.

［13］邢 茂，張恩娟，葉 鑫.三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡途徑的研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2002，18(1):87.