庫(kù)爾勒香梨"黑頭病"病原菌的分離和初步鑒定

唐文娟，陳君慧，任雷厲，劉 琦，陳國(guó)剛，江 英

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003)

庫(kù)爾勒香梨"黑頭病"病原菌的分離和初步鑒定

唐文娟，陳君慧，任雷厲，劉 琦，陳國(guó)剛，江 英*

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003)

近年來(lái)，庫(kù)爾勒香梨在貯藏中極易發(fā)生一種新型微生物病害——“黑頭病”。本文對(duì)香梨黑頭病病原菌分離、純化和形態(tài)學(xué)進(jìn)行初步鑒定。其結(jié)果表明，侵染黑頭病香梨的病原菌有七株病原菌，分屬于枝孢屬(Cladosporium，簡(jiǎn)稱C)、青霉屬(Penicillium，簡(jiǎn)稱P)、鏈格孢屬(Alternaria，簡(jiǎn)稱AL)和曲霉屬(Aspergillus，簡(jiǎn)稱AS)，同時(shí)通過(guò)致病性實(shí)驗(yàn)確定致病菌為真菌界(Fungi)半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)。

庫(kù)爾勒香梨，黑頭病，致病性，初步鑒定

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

庫(kù)爾勒香梨 購(gòu)于石河子農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);致病庫(kù)爾勒香梨 貯藏于庫(kù)爾勒、阿克蘇氣調(diào)庫(kù)和冷庫(kù)的發(fā)病梨;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基［3］PDA 成分:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，pH自然。

1.2 香梨黑頭病病原菌的分離和純化

依據(jù)柯赫氏法則從香梨的病健交界處切下病組織，移至PDA平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)28～36h觀察。再?gòu)某醴蛛x的菌落回接與未致病香梨進(jìn)行致病性能的再確定，同時(shí)重復(fù)上述步驟得到初分離菌落用PDA平板進(jìn)行稀釋純化培養(yǎng)，直到分離出菌落大小、形狀、顏色、表面光滑濕潤(rùn)程度、菌絲生長(zhǎng)快慢、菌絲形狀、產(chǎn)孢情況、孢子顏色、形狀等一致的若干菌株［4］。

1.3 香梨黑頭病致病性的研究

表1 病原菌在PDA平板上的生長(zhǎng)特性和顯微特性

1.3.1 香梨黑頭病致病菌的確定 將香梨用70%酒精將面朝上部的香梨梨體擦拭一遍，待干燥后用滅菌接種針刺破五個(gè)大小深度一致的小孔，然后用打孔器打取純化后的單一菌株分別接至傷口，每一種菌株處理五個(gè)香梨放入無(wú)菌保鮮袋內(nèi)，以穿刺后不接種進(jìn)行對(duì)照。以25℃LRH保持在90%以上培養(yǎng)5～15d對(duì)其進(jìn)行觀察。如果癥狀與致病香梨癥狀一樣，則確定該菌株是致病菌。

1.3.2 香梨黑頭病致病菌不同接種量對(duì)香梨致病力的影響 用滅菌棉吸附70%的酒精對(duì)香梨表面擦洗消毒處理，再用無(wú)菌水洗凈晾干后備用。在香梨萼部上用無(wú)菌接種針刺五個(gè)孔，其孔徑直徑約5mm，將不同濃度的菌懸液分別接種至傷口處，每個(gè)濃度重復(fù)三次，放入無(wú)菌保鮮袋內(nèi)，以穿刺后無(wú)菌水接種進(jìn)行對(duì)照。25℃恒溫培養(yǎng)，LRH保持在90%以上培養(yǎng)5～15d后觀察結(jié)果［4］。

1.4 致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定［5-6］

1.4.1 三點(diǎn)培養(yǎng) 在平板底部以等邊三角形標(biāo)上三點(diǎn)。將接種針先在火焰上燒紅滅菌，并在平板培養(yǎng)基的邊緣冷卻且蘸濕后伸入菌種管，用針尖沾取少量致病菌株孢子，以水平法把接種針上沾著的孢子以垂直的方向輕輕地點(diǎn)接到平板培養(yǎng)基表面預(yù)先做好標(biāo)記的部位。最后將點(diǎn)接好的平板倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，2d后觀察其菌落特征。

1.4.2 載玻片培養(yǎng) 向滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)加入2～3mL無(wú)菌水，再放入一個(gè)滅菌U形玻璃管。取一載片沾取酒精在酒精燈上灼燒滅菌，立即放入培養(yǎng)皿中。用一根沾取酒精灼燒滅菌后沾取已融化的PDA培養(yǎng)基少許均勻涂布在玻片中央。用接種環(huán)挑取少量致病菌種的孢子接種于濕室內(nèi)載玻片的培養(yǎng)基上。將其放在28℃恒溫箱中培養(yǎng)，2d后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 香梨黑頭病的主要癥狀

通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病在香梨入庫(kù)4月后開(kāi)始發(fā)病，且這種病害主要出現(xiàn)在宿萼果(“公梨”)上［2］。其主要癥狀:發(fā)病初期首先是果實(shí)萼部果皮出現(xiàn)黑褐色斑塊，繼而果實(shí)萼部果肉開(kāi)始褐變軟化，病斑處果皮皺縮、干硬，由果實(shí)萼部向果心擴(kuò)大，最終病部呈現(xiàn)深褐色凹陷狀。

2.2 致病香梨病原菌的分離和純化

將黑頭病香梨病原菌在PDA培養(yǎng)基上分離純化，其結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，分離、純化得到七株病原菌。分屬為枝孢屬(Cladosporium，簡(jiǎn)稱C)、青霉屬(Penicillium，簡(jiǎn)稱P)、鏈格孢屬(Alternaria，簡(jiǎn)稱AL)和曲霉屬(Aspergillus，簡(jiǎn)稱AS)。

2.3 香梨黑頭病的致病性

2.3.1 香梨“黑頭病”致病菌的確定 將分離純化后的單一菌落接種至香梨萼部，在25℃生化培養(yǎng)箱中，LRH保持在90%以上培養(yǎng)4～15d，其結(jié)果表明，除菌株號(hào)FD-1(C)與香梨“黑頭病”發(fā)病癥狀一致，其余六株的最終癥狀都為腐爛，因此，確定菌株號(hào)FD-1 (C)為香梨“黑頭病”致病菌，七株菌株在香梨萼部發(fā)病癥狀與發(fā)病時(shí)間如表2所示。

2.3.2 香梨“黑頭病”致病菌不同接種量對(duì)香梨致病力的影響 通過(guò)對(duì)香梨萼部進(jìn)行“黑頭病”致病菌不同接種量的接種實(shí)驗(yàn)，可以初步估計(jì)接種量對(duì)香梨致病力的影響，以及其發(fā)病所需時(shí)間，結(jié)果表明，接種量越大，發(fā)病所需時(shí)間越短，其致病菌的不同濃度接種于香梨中，發(fā)病情況如表3所示。

表2 香梨致病性測(cè)定情況

表4 香梨“黑頭病”致病菌形態(tài)學(xué)特征

表3 致病菌不同濃度下的發(fā)病情況

2.4 香梨“黑頭病”致病菌的鑒定

通過(guò)香梨“黑頭病”致病性測(cè)定，得出導(dǎo)致香梨“黑頭病”的致病菌為FD-1(C)，這種病原菌能導(dǎo)致香梨萼部出現(xiàn)“黑頭病”癥狀，通過(guò)菌種的培養(yǎng)特性和顯微特性分析，參照《真菌鑒定手冊(cè)》［7］、《中國(guó)真菌志》［8］、《植物病原真菌學(xué)》［9］及《真菌的形態(tài)和分類》［10］對(duì)其進(jìn)行鑒定，其菌落形態(tài)學(xué)特性如表4和圖1。

根據(jù)香梨“黑頭病”致病菌三點(diǎn)培養(yǎng)法和載玻片培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特性，可以初步確定菌株號(hào)FD-1(C)為真菌界(Fungi)半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)。

3 結(jié)論

圖1 致病菌形態(tài)圖

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)香梨“黑頭病”病原菌的分離與純化實(shí)驗(yàn)共得到七株病原菌，歸屬與四個(gè)屬，分別為枝孢屬(Cladosporium，簡(jiǎn)稱C)、青霉屬(Penicillium，簡(jiǎn)稱P)、鏈格孢屬(Alternaria，簡(jiǎn)稱 AL)和曲霉屬(Aspergillus，簡(jiǎn)稱AS)。對(duì)七株病原菌致病性結(jié)果表明，引起香梨“黑頭病”的主要致病菌為菌株號(hào)FD-1 (C)，根據(jù)菌落形態(tài)學(xué)特性初步確定FD-1(C)為真菌界(Fungi)半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)。同時(shí)香梨“黑頭病”致病菌不同接種量的結(jié)果表明，接種濃度越大，其發(fā)病時(shí)間越短。

［1］中國(guó)農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料［M］.北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007: 106-113.

［2］何子順，牛建新，邵月霞.庫(kù)爾勒香梨果實(shí)萼片脫落與宿存研究概況［J］.中國(guó)果菜，2006(2):10.

［3］方中達(dá).植病研究方法［M］.北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1979:83.

［4］許玲，李學(xué)文，騰康寧.果蔬采后致病真菌的檢測(cè)及其控制［J］.食品科學(xué)，2003，24(7):155-158.

［5］怎樣觀察與培養(yǎng)微生物［M］.北京師范大學(xué)出版社，1982: 54-55.

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［7］魏景超.真菌鑒定手冊(cè)［M］.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979:83.

［8］張中義.中國(guó)真菌志第十四卷:枝孢屬、黑星孢屬、梨孢屬［M］.北京科學(xué)出版社，2005:7-10.

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Isolation and identification the pathogens of blackhead disease of Kuerle pear

TANG Wen-juan，CHEN Jun-hui，REN Lei-li，LIU Qi，CHEN Guo-gang，JIANG Ying*
(Food College，Shihezi University，Shihezi 832003，China)

The“Blackhead disease”of pear is a new pear disease that produced in recent years.In the issue，separation，purification and morphology of pear’s“Blackhead disease”was preliminarily identified and seven species classified in the Cladosporium，Penicillium，Alternaria，Aspergillus genuses were obtained.The results got from the assay of pathogenicity were showed that Fungi Deuteromycotina Hyphomycetes Hyphomycetales Dematiaceae Cladosporium was major pathogen of root rot of Blackhead disease kuerle pear.

Kuerle pear;blackhead disease;pathogenicity;primary identification

TS255.1

A

1002-0306(2011)03-0366-04

庫(kù)爾勒香梨是新疆傳統(tǒng)的優(yōu)質(zhì)特色果品，新疆特定的地理氣候條件賦予庫(kù)爾勒香梨特殊的品質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007年庫(kù)爾勒香梨的產(chǎn)量約為44萬(wàn)t，每年出口量在3萬(wàn)t左右，平均出口離岸價(jià)遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)其它梨品種和大多數(shù)果品，顯示出較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)［1］。近年來(lái)，其生產(chǎn)規(guī)模逐年擴(kuò)大，主要分布在庫(kù)爾勒地區(qū)和阿克蘇地區(qū)，在貯藏中受病害影響，大大降低了商品價(jià)值?！昂陬^病”(當(dāng)?shù)毓r(nóng)自稱)是庫(kù)爾勒香梨的新型病癥。通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，阿克蘇產(chǎn)區(qū)貯藏庫(kù)群的發(fā)病率明顯高于庫(kù)爾勒地區(qū)，“黑頭病”發(fā)病率高達(dá)2%～4%;而庫(kù)爾勒地區(qū)“黑頭病”發(fā)病率小于2%，并且這種病害在冷庫(kù)及氣調(diào)庫(kù)均有發(fā)生。目前，香梨黑頭病主要出現(xiàn)在宿萼果(“公梨”)上［2］。本文的研究為香梨黑頭病的抗病性研究及防治措施奠定理論依據(jù)，從而降低黑頭病發(fā)病率，提高香梨貯藏品質(zhì)，促進(jìn)香梨的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

2010-06-12 *通訊聯(lián)系人

唐文娟(1985-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

石河子大學(xué)“自然科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目”(ZRKX2009YB)。