驢骨蛋白多肽對(duì)小白鼠抗疲勞作用的研究

繆?？。?智，吳本行，董繼文，孫 浩，李 彪，康 柳

(西南林業(yè)大學(xué)，西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224)

驢骨蛋白多肽對(duì)小白鼠抗疲勞作用的研究

繆?？?，熊 智*，吳本行，董繼文，孫 浩，李 彪，康 柳

(西南林業(yè)大學(xué)，西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224)

研究驢骨酶解產(chǎn)物蛋白多肽對(duì)小鼠的抗疲勞作用，對(duì)利用廢棄驢骨蛋白資源來(lái)開(kāi)發(fā)其深加工產(chǎn)品具有重要意義。通過(guò)對(duì)小鼠灌胃不同劑量的驢骨蛋白多肽粉(專利申請(qǐng)?zhí)?201010198758.2)，經(jīng)30d后測(cè)定小鼠體重、負(fù)重游泳力竭時(shí)間、肝糖原和血乳酸的含量，研究驢骨蛋白多肽的抗疲勞生理活性。結(jié)果表明:驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但是能明顯延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，降低血乳酸含量，增加肝糖原含量。說(shuō)明驢骨蛋白多肽粉具有緩解小鼠疲勞反應(yīng)、增加小鼠抗疲勞的作用，為利用驢骨資源提供科學(xué)的理論依據(jù)。

驢骨，蛋白多肽，抗疲勞

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮驢腿骨 云南楚雄養(yǎng)驢基地提供;木瓜蛋白酶 活力15萬(wàn)U/g;昆明種雄性小鼠 昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(滇)2005-0008)，120只，體重(20±2)g。

1.2 驢骨蛋白多肽粉的制備

驢骨蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法:凱氏定氮法［11］。

驢骨多肽提取工藝:采用酶解工藝:

新鮮驢腿骨→砸碎→高壓蒸煮→骨湯共同粉碎→分離脂肪→骨粉懸浮液→酶解→濃縮、干燥→驢骨多肽粉(此工藝已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?201010198758.2)。

1.3 酶解液分析

氮溶出率的測(cè)定(NSI)［12］:氮溶出率(%)=酶解液總氮量/骨粉中總氮量×100%。

三氯乙酸溶解指數(shù)(TCA-NSI)的測(cè)定［12］:TCANSI(%)=上清液中總氮量/酶解液中總氮×100%。

1.4 小鼠抗疲勞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 小鼠分組 將120只昆明種系實(shí)驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組和3個(gè)受試物組，每天灌胃劑量為(低劑量組:1.2g/kg、中劑量組:3.5g/kg、高劑量組:7.0g/kg)，空白對(duì)照灌胃同體積生理鹽水。灌胃期間，自由進(jìn)食(合成鼠料)、飲水，連續(xù)灌喂30d后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

表2 驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

1.4.2 抗疲勞實(shí)驗(yàn) 根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)的方法［13］，測(cè)定小鼠體重、負(fù)重游泳時(shí)間﹑血乳酸和肝糖原含量。

小鼠游泳實(shí)驗(yàn):末次給予受試物30min后，將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。箱中水深不少于30cm，水溫(25±1)℃，記錄小鼠自游泳開(kāi)始至死亡的時(shí)間。

肝糖原測(cè)定:末次給予受試物30min后，于25℃水中不負(fù)重游泳90min處死動(dòng)物，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干后置于冰面上的平皿內(nèi)，迅速稱取肝臟200mg，測(cè)定肝糖原含量(蒽酮法)。

血乳酸測(cè)定:末次給予受試物30min后，將動(dòng)物置溫度為25℃的水中不負(fù)重游泳20min，并于游泳后立即采眼球血20μL，測(cè)定乳酸含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用t檢驗(yàn)來(lái)比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢骨蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

經(jīng)凱氏定氮儀測(cè)定，驢骨蛋白質(zhì)平均含量為25.25%，比豬骨蛋白含量12.0%，牛骨蛋白含量11.5%等的含量要高出十個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明驢骨中蛋白的含量較其它動(dòng)物的骨蛋白含量高，其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值巨大。

2.2 酶解液特性分析

骨蛋白的溶解度大小，無(wú)論對(duì)理論研究還是實(shí)際應(yīng)用都是十分重要的。NSI是樣品中能夠溶于特定溶劑中的氮占總氮的百分率，TCA-NSI的高低反映了酶解產(chǎn)物的生化特性，以及產(chǎn)品中肽鏈的長(zhǎng)短，一般認(rèn)為T(mén)CA-NSI越大，肽鏈越短。小分子肽類(lèi)具有良好酸溶性、低黏度、良好生理活性、在體內(nèi)消化吸收快、利用率高等優(yōu)點(diǎn)。

從表1可知，水解產(chǎn)物pH在3～11范圍內(nèi)NSI高達(dá)75%，且pH在5～9之間NSI可達(dá)到88%。說(shuō)明驢骨蛋白酶解產(chǎn)物具有高溶解性，在相當(dāng)寬的pH范圍內(nèi)pH的影響較小。經(jīng)測(cè)定酶解產(chǎn)物的TCANSI為84%，說(shuō)明其水解產(chǎn)物絕大部分為低分子肽類(lèi)。這兩個(gè)特點(diǎn)決定驢骨蛋白酶解產(chǎn)物可直接應(yīng)用于食品中。

表1 酶解液在不同的pH下的NSI

2.3 抗疲勞實(shí)驗(yàn)

2.3.1 驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠體重及負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

由表2可見(jiàn)，各組小鼠灌胃30d后，經(jīng)t檢驗(yàn)，體重變化無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，說(shuō)明驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠的體重沒(méi)有明顯影響。各劑量組的小鼠負(fù)重游泳時(shí)間隨著劑量的增多而延長(zhǎng)，均高于對(duì)照組，中劑量組與對(duì)照組的差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，高劑量組與對(duì)照組的差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。說(shuō)明驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力有明顯的增強(qiáng)作用，而運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最有力的宏觀表現(xiàn)。

2.3.2 驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠肝糖原的影響 糖原是運(yùn)動(dòng)能量的重要來(lái)源，糖原的儲(chǔ)存量可以直接影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，肝糖原含量直接反映機(jī)體糖原代謝情況。機(jī)體在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)肝糖原耗竭，導(dǎo)致葡萄糖異生作用受抑制，血糖濃度降低，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生干擾而出現(xiàn)疲勞［14］。由表3可見(jiàn)，各劑量組的小鼠肝糖原含量隨著劑量的增加而明顯增多，表明驢骨蛋白多肽粉能促進(jìn)小鼠機(jī)體中的糖原含量，中、高劑量組與對(duì)照組相比，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異分別達(dá)到顯著水平(P＜0.05)和極顯著水平(P＜0.01)，即劑量的高低能直接影響機(jī)體中糖原的量，對(duì)機(jī)體抗疲勞有明顯的促進(jìn)作用。

表3 驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠肝糖原含量的影響

2.3.3 驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量的影響 乳酸的積累是運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的重要因素，其乳酸含量變化對(duì)評(píng)價(jià)受試動(dòng)物的抗疲勞作用非常靈敏。由于肌肉在劇烈收縮時(shí)供應(yīng)的氧有限，肌細(xì)胞內(nèi)糖原和葡萄糖分解的同時(shí)產(chǎn)生大量乳酸。乳酸的增加使肌肉中pH下降，導(dǎo)致疲勞［15-16］。由表4可見(jiàn)，小鼠的血乳酸隨著劑量的增加而明顯減少，中、高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量明顯降低，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異分別達(dá)到顯著水平(P＜0.05)和極顯著水平(P＜0.01)。表明驢骨蛋白多肽粉能降低小鼠機(jī)體的血乳酸量，在中、高劑量時(shí)其作用效果顯著，能有效地緩解小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞。

表4 驢骨蛋白多肽粉對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酪含量的影響

3 結(jié)論

驢骨蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解后其酶解產(chǎn)物在pH5～9范圍內(nèi)，氮溶解指數(shù)高于88%，三氯乙酸氮溶解指數(shù)達(dá)84%。該酶水解的產(chǎn)物具有較高的溶解性，大部分為低分子肽，可直接應(yīng)用于食品中。

驢骨蛋白多肽粉受試樣品可延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、提高小鼠肝糖原的含量、降低運(yùn)動(dòng)后的血乳酸含量，且與對(duì)照組相比差異顯著。依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)緩解體力疲勞功能的標(biāo)準(zhǔn)判斷，驢骨蛋白多肽粉具有緩解體力疲勞功能。

4 討論

目前運(yùn)動(dòng)性疲勞評(píng)價(jià)方法應(yīng)用較多的主要有兩種:耐力實(shí)驗(yàn)和生化檢測(cè)。機(jī)體的耐力以機(jī)體連續(xù)運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間反映。本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，以小鼠力竭游泳時(shí)間作為判斷小鼠耐力程度的指標(biāo);生化指標(biāo)選擇有兩類(lèi):a.能量物質(zhì):肝糖元。b.代謝產(chǎn)物:血乳酸。各指標(biāo)在運(yùn)動(dòng)時(shí)變化明顯，而且變化程度與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷強(qiáng)度一致，可作為疲勞的評(píng)價(jià)指標(biāo)［17］。驢骨蛋白多肽粉能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，有利于增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng);能提高小鼠肝糖原的含量，有助于提高耐力和運(yùn)動(dòng)能力，抵抗疲勞，糖原是運(yùn)動(dòng)能量的重要來(lái)源，糖原的儲(chǔ)存量可以直接影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，肝糖原含量直接反映機(jī)體糖原代謝情況;能降低運(yùn)動(dòng)后的血乳酸含量，可進(jìn)一步增強(qiáng)抵抗疲勞，血乳酸作為肌肉活動(dòng)的主要代謝產(chǎn)物，持續(xù)運(yùn)動(dòng)后血乳酸的數(shù)值越低，表明疲勞消除越快。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果:驢骨蛋白多肽粉能夠增強(qiáng)小鼠機(jī)體抗疲勞功能?？蔀轶H骨蛋白后期的開(kāi)發(fā)與利用提供科學(xué)的理論依據(jù)，有很好的深加工前景，有待進(jìn)一步的研究。

［1］童軍鋒.畜禽骨的綜合利用［J］.肉類(lèi)工業(yè)，1999(6): 9-10.

［2］楊迎伍.畜骨的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］.食品科技，2002(1):60-61.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［4］孫衛(wèi)青.骨食品開(kāi)發(fā)研究前景廣闊［J］.肉類(lèi)工業(yè)，2001 (1):43-44.

［5］趙新淮.酶促水解大豆分離蛋白的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1994(5):7-10.

［6］鄭建仙.功能性食品［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1994.

［7］Surówka K，Surówka J，Surówka J.Enzymatic Modification of extruded soy protein concentrateasa method of obtaining new functional food components［J］.Trends Food Sci Technol，2004，15:153-160.

［8］LeeKA，KimSH.SSG Eand DEE，new peptides isolated Fromasoy protein hydroly sate that inhibit platelet aggregation［J］.FoodChem，2005，90:389-393.

［9］尤新.功能性發(fā)酵制品［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000.

［10］林丹，王琪，鄧超，等.霞水母膠原蛋白活性肽和寡肽膠原抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2010，22:113-116.

［11］侯曼玲.食品分析［M］北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［12］韓雅珊.食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992.

［13］保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范［S］.2003:87-93.

［14］張肅，胡春曉，金莉莉，等.東北林蛙卵蛋白抗疲勞活性研究［J］.特產(chǎn)研究，2010(1):7-8.

［15］李永進(jìn)，楊睿悅，扈學(xué)俸，等.火麻仁蛋白對(duì)小鼠抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)功能的初步研究［J］.衛(wèi)生研究，2008，37(2): 175-178.

［16］文鏡，王津，金宗濂.通過(guò)小鼠運(yùn)動(dòng)后血尿素變化規(guī)律觀察中藥的抗疲勞作用［J］.北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，1增刊(2):192。

［17］王亞?wèn)|，王海玉，李立，等.五加皮酒抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(6):1404-1405.

Study on antifatigue effects of donkey bone peptide in mice

MIAO Fu-jun，XIONG Zhi*，WU Ben-hang，DONG Ji-wen，SUN Hao，LI Biao，KANG Liu
(Southwest Forestry University，Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，Kunming 650224，China)

To study the anti-fatigue function of the donkey bone peptide on mice that was significant to study of fully excavating bone protein resources and developing the deep processed products.The weight，loading swimming time，the content of blood lactic acid and liver glycogen of the experimental mice were measured after 30 days through being given different doses of the donkey bone peptide to mice.The result showed the donkey bone peptide could have no obvious impact on the weight and significantly prolong swimming time，increased the reserves of liver glycogen，and decreased the content of blood lactic acid，which indicated the peptide of donkey bone has anti-fatigue function and that would provide a theoretical basis for excavating bone protein resources.

donkey bone;peptide;anti-fatigue

TS201.4

A

1002-0306(2011)11-0411-03

我國(guó)是世界上養(yǎng)豬、羊、驢、禽最多的國(guó)家，驢肉產(chǎn)量位居世界第一，每年有大量的驢骨產(chǎn)生［1-2］。而且目前，云南楚雄州驢生物產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)建設(shè)項(xiàng)目已經(jīng)啟動(dòng)，未來(lái)的幾年內(nèi)，毛驢養(yǎng)殖規(guī)模將達(dá)66萬(wàn)頭以上。驢全身都是寶，開(kāi)發(fā)利用價(jià)值很大，驢皮具有很高的醫(yī)藥價(jià)值，是制作“國(guó)藥瑰寶—阿膠”的主要原料，而驢骨與驢皮含有相同的骨膠原蛋白［3］，但這些骨骼除部分以骨粉等初級(jí)加工形式利用外，往往都被廢棄，致使大量寶貴營(yíng)養(yǎng)資源流失并導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染［4］。利用酶解技術(shù)將骨蛋白水解成多肽，而多肽與蛋白質(zhì)和氨基酸相比具有更多優(yōu)點(diǎn):多肽在腸道中的吸收率高于蛋白質(zhì)和氨基酸［5］;多肽具有促進(jìn)脂質(zhì)代謝、降低膽固醇、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、促進(jìn)機(jī)體免疫等生理功能［6-8］;多肽具有較好的酸、熱穩(wěn)定性，水溶性，而且具有良好的抗疲勞活性［9］。國(guó)內(nèi)外研究者尤其是運(yùn)動(dòng)學(xué)家們?cè)絹?lái)越重視天然補(bǔ)益性抗疲勞藥物或食品的研究，為提高運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)耐力，延緩疲勞發(fā)生，加快疲勞恢復(fù)，目前已研制出許多抗疲勞制品［10］。但有關(guān)驢骨蛋白的抗疲勞作用研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究以新鮮驢腿骨為實(shí)驗(yàn)原料，采用食品級(jí)木瓜蛋白酶水解制備驢骨蛋白多肽粉，對(duì)其進(jìn)行小鼠抗疲勞研究，為充分挖掘骨蛋白資源及開(kāi)發(fā)骨蛋白深加工產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

2010-10-15 *通訊聯(lián)系人

繆?？?1986-)，男，碩士研究生，研究方向:植物生物技術(shù)。

云南省教育廳基金項(xiàng)目(09J0066)。