響應(yīng)面法優(yōu)化植酸酶水解大豆分離蛋白的工藝

張仁楠，姚 磊，富校軼，，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

響應(yīng)面法優(yōu)化植酸酶水解大豆分離蛋白的工藝

張仁楠1，姚 磊2，富校軼1，2，*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

以大豆分離蛋白為實(shí)驗(yàn)材料，在酶解溫度、酶添加量、pH、水解時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平響應(yīng)曲面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的主要影響因素，以大豆分離蛋白中植酸的去除率為響應(yīng)值作響應(yīng)面。植酸去除的最佳工藝條件為:反應(yīng)溫度44.87℃，酶添加量為8.24%，pH為5.54，反應(yīng)時(shí)間為3.03h。在最佳工藝條件下，植酸的去除率為95.15%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為94.98%。

大豆分離蛋白，植酸，植酸酶，響應(yīng)面

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 購(gòu)自哈工大;植酸酶 購(gòu)自Sigma公司(小麥中提取，0.03U/mg);其它試劑 分析純。

電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司; TU-1901雙光速紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;Z36HK低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司;高速離心機(jī)，PP-25E型酸度計(jì)，HH-8恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植酸的測(cè)定 采用測(cè)鐵分光光度法于500nm測(cè)定植酸的含量［10］。

1.2.2 影響植酸去除率的單因素實(shí)驗(yàn) 以植酸去除率為指標(biāo)，分別選取水解溫度，酶添加量，pH和水解時(shí)間進(jìn)行植酸酶酶解大豆分離蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Box-Behnken模型，以水解溫度，酶添加量，pH和水解時(shí)間為主要考察因素。因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)溫度對(duì)植酸去除率的影響

取10mL離心管20支，(共五個(gè)溫度點(diǎn)，每個(gè)溫度點(diǎn)一個(gè)對(duì)照管三個(gè)實(shí)驗(yàn)管)。每管均加入待測(cè)樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，分別在30、35、40、45、50、55℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實(shí)驗(yàn)管中分別加入酶溶液0.5mL，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，在加酶后的1h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活?？疾觳煌磻?yīng)溫度對(duì)植酸去除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)植酸去除率的影響

由圖1可見(jiàn)，溫度在30～45℃之間時(shí)，植酸的去除率隨著溫度的增加而增加。但當(dāng)溫度大于45℃時(shí)，植酸的去除率隨溫度的升高而下降。植酸酶的最適溫度約為45℃，符合植物性植酸酶的最適溫度(45～60℃)。所以，在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中植酸酶水解溫度選擇40～50℃。

2.2 酶添加量對(duì)植酸去除率的影響

取10mL離心管20支，(共五個(gè)溫度點(diǎn)，每個(gè)溫度點(diǎn)一個(gè)對(duì)照管三個(gè)實(shí)驗(yàn)管)。每管均加入待測(cè)樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，37℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實(shí)驗(yàn)管中分別加入 1.34%、2.68%、5.36%、8.04%、10.72%的酶液，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，在加酶后的1h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活?？疾觳煌柑砑恿繉?duì)植酸去除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可見(jiàn)，隨著酶添加量的增加，植酸的去除率逐漸增加，酶添加量為8.04%時(shí)水解效果好。所以，在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中植酸酶的添加量選擇5.36%～10.72%。

2.3 pH對(duì)植酸去除率的影響

圖2 酶添加量對(duì)植酸去除率的影響

取10mL離心管36支，(共九個(gè)pH點(diǎn)，每個(gè)pH點(diǎn)一個(gè)對(duì)照管三個(gè)實(shí)驗(yàn)管)。每管均加入待測(cè)樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，調(diào)節(jié)pH，在37℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實(shí)驗(yàn)管中分別加入酶溶液0.5mL，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，在加酶后的1h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活，考察不同pH對(duì)植酸去除率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH對(duì)植酸去除率的影響

由圖3可見(jiàn)，pH 2.5～5.5時(shí)，植酸的去除率隨pH增加而升高。pH為5.5時(shí)植酸的去除率達(dá)到最大值，效果最好。植酸酶的最適pH約為5.5，符合植物性植酸酶的最適pH 4～6。所以，在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中植酸酶水解pH選擇5.0～6.0。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)植酸去除率的影響

取10mL離心管28支，(共七個(gè)溫度點(diǎn)，每個(gè)溫度點(diǎn)一個(gè)對(duì)照管三個(gè)實(shí)驗(yàn)管)。每管均加入待測(cè)樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，加入到37℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實(shí)驗(yàn)管中分別加入酶溶液0.5mL，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，分別在加酶后的0.5、1、2、2.5、3、3.5、4h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活?？疾觳煌磻?yīng)時(shí)間對(duì)植酸去除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)植酸去除率的影響

從圖4可見(jiàn)，水解時(shí)間小于3h時(shí)，植酸的去除率呈上升趨勢(shì)，酶與底物反應(yīng)需要一定的時(shí)間;之后植酸的去除率趨于不變，可見(jiàn)底物完全被水解。因此，水解時(shí)間為3h時(shí)效果最好。所以，在下面的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中植酸酶水解時(shí)間選擇2.5～3.5h。

2.5 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 模型建立 根據(jù)實(shí)驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)，采用不同的反應(yīng)溫度，酶添加量，pH和反應(yīng)時(shí)間。進(jìn)行29次實(shí)驗(yàn)。各因素安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)表2在不同條件下所測(cè)得的植酸去除率，利用Design expert 7.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸擬合，得到植酸去除率(Y)的回歸方程:

2.5.2 模型方差分析 利用Design expert 7.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析和回歸方程系數(shù)估計(jì)值，見(jiàn)表3。

回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)(響應(yīng)值)影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P的值越小，則響應(yīng)變量的顯著性越高。由表3可知，四個(gè)因素的Prob＞F值相差較大，對(duì)提取結(jié)果的影響順序?yàn)?酶添加量＞pH＞水解溫度＞水解時(shí)間。從方差分析可以看出模型Prob＞F值小于0.01，表明該模型方程高度顯著，不同處理間的差異高度顯著。模型失擬項(xiàng)的Prob＞F值0.8833＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，模型選擇合適。由此可見(jiàn)，各具體實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù) R2=3082.37/3186.16= 0.967(大于0.8)，說(shuō)明植酸去除率(Y)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，因此該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值植酸去除率(Y)的實(shí)際情況。

表3 回歸方程的方差分析

2.5.3 響應(yīng)曲面分析與最優(yōu)工藝條件的確定 根據(jù)回歸分析結(jié)果，做出相應(yīng)曲面圖，如圖5～圖8所示。從相應(yīng)曲面分析圖上可以找到最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的交互作用。

圖5 酶添加量與溫度的交互作用

圖6 溫度與pH的交互作用

圖5～圖8直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。比較4組圖可知，水解時(shí)間、水解溫度、酶添加量和pH對(duì)植酸的去除率影響均較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。

植酸去除率的響應(yīng)面趨勢(shì)呈拋物線形，因此回歸方程有極大值，結(jié)合方程與響應(yīng)曲面可得到植酸酶水解大豆分離蛋白中植酸的最優(yōu)參數(shù)為:反應(yīng)溫度44.87℃，酶添加量為8.24%，pH為5.54，反應(yīng)時(shí)間為3.03h，植酸的去除率為95.15%。

圖7 酶解時(shí)間與酶添加量的交互作用

圖8 水解時(shí)間與pH的交互作用

根據(jù)最佳工藝條件，做三組驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 最佳工藝條件驗(yàn)證結(jié)果

由表4可以看出，在所得的最佳工藝條件下植酸的去除率與預(yù)測(cè)值接近，因此進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以及在此基礎(chǔ)上通過(guò)四因素三水平響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，建立了響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，依此模型可以預(yù)算理論植酸去除率。用響應(yīng)面分析法對(duì)植酸酶水解大豆分離蛋白的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到的回歸方程為:

對(duì)植酸去除率影響較大的四個(gè)因素的Prob＞F值相差較大，對(duì)提取結(jié)果的影響順序?yàn)?酶添加量＞pH＞水解溫度＞水解時(shí)間。根據(jù)回歸模型，確定植酸酶水解大豆分離蛋白的最佳工藝參數(shù):反應(yīng)溫度為44.87℃，酶添加量為8.24%，pH為5.54，反應(yīng)時(shí)間為3.03h，在此條件下，植酸的去除率為95.15%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為94.98%。

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Optimization of phytase hydrolysis of soybean protein isolated by response surface methodology

ZHANG Ren-nan1，YAO Lei2，F(xiàn)U Xiao-yi1，2，*
(1.Northeast Agricultural University，College of Food Science，Harbin150030，China; 2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

With soybean protein isolated as experiment material，on the base of single factor experiments(hydrolysis time，hydrolysis temperature and so on)，then through the experimental design of response surface methodology with four factors and three levels based on the principle of Box-Behnken design，the conditions of hydrolysis were studied.The optimal hydrolysis conditions:hydrolysis temperature was 44.87℃，exterior phytase addition about 8.24%，pH was 5.54，hydrolysis time was 3.03h.Experiments that checked the optimal hydrolysis time conditions showed that phytate of soybean protein isolated was degraded about 95.15%，proof test result was 94.98%.

soybean protein isolated;phytate;phytase;response surface methodology

TS201.2+1

B

1002-0306(2011)11-0292-04

植酸，化學(xué)名環(huán)乙六醇六磷酸酯(IP6)，廣泛存在于谷類(lèi)、水果、蔬菜和干果等植物性食物中［1］。大豆中60%～80%的磷都是以植酸態(tài)的形式存在的，大豆中的植酸含量可達(dá)2%。植酸是一種很強(qiáng)的絡(luò)合劑，其12個(gè)酸基在腸胃中能牢固地絡(luò)合帶正電荷的Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+等二價(jià)和多價(jià)金屬離子，形成難溶性的植酸鹽絡(luò)合物，從而影響這些元素的吸收。另外，植酸還能與大豆蛋白或一些酶結(jié)合，形成植酸蛋白質(zhì)復(fù)合物，影響蛋白質(zhì)的生理功能［2-5］，降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。植酸酶是一種特殊的酸性磷酸酶［6］，能催化水解植酸植酸鹽向正磷酸鹽及其他磷酸肌醇中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，從而釋放出磷酸根離子［7］，把原來(lái)無(wú)法利用的磷變?yōu)橛行Я锥粍?dòng)物吸收利用，間接地起到補(bǔ)充磷的作用［8］。關(guān)于谷物中植酸去除的研究不少，但方法不一，效果也不盡相同［9］。本實(shí)驗(yàn)將響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)應(yīng)用于植酸酶去除大豆分離蛋白中植酸工藝的優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，從而改善植酸去除的效果，為大豆產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

2010-09-07 *通訊聯(lián)系人

張仁楠(1987-)，女，碩士，主要從事糧食、油脂與農(nóng)產(chǎn)品加工及儲(chǔ)藏方面的研究工作。

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z332);黑龍江省青年基金項(xiàng)目(41400075-6-08003)。