生甘遂與制甘遂中的二萜類成分甘遂大戟萜酯D的含量研究△

程顯隆，肖新月*，鄒秦文，劉薇，石巖，魏鋒，馬雙成*，林瑞超

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京聯(lián)馨藥業(yè)有限公司，北京 102628)

質(zhì) 量

國(guó)家科技支撐計(jì)劃——常見(jiàn)與重要藥品安全標(biāo)準(zhǔn)研究(2006BAI14B01)，國(guó)家科技重大專項(xiàng)——中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和信息化體系建設(shè)平臺(tái)(2009ZX093008-004)

*肖新月, E-mail:xiaoxy@sina.com；*馬雙成，E-mail：mashuangcheng@yahoo.com

生甘遂與制甘遂中的二萜類成分甘遂大戟萜酯D的含量研究△

程顯隆1，肖新月1*，鄒秦文2，劉薇1，石巖1，魏鋒1，馬雙成1*，林瑞超1

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京聯(lián)馨藥業(yè)有限公司，北京 102628)

目的建立甘遂中甘遂大戟萜酯D的含量測(cè)定方法，并比較生甘遂和醋甘遂中甘遂大戟萜酯D的含量差異。方法樣品以甲醇為提取溶劑，超聲處理后，以HPLC法分析。采用菲羅門(mén) lunar C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱分離，柱溫40 ℃，以乙腈-水(70∶30)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。結(jié)果甘遂大戟萜酯D線性范圍分別為0.216～8.64 μg(r=0.999 9)，平均加樣回收率為103.5 %(n=9)；44批次甘遂中，甘遂大戟萜酯D的含量為0.008 %～0.036 %。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、可靠，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于甘遂大戟萜酯D的定量分析。

甘遂；醋甘遂；甘遂大戟萜酯D；高效液相色譜法

甘遂始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品?！吨袊?guó)藥典》2010年版收載的甘遂為大戟科(Euphobiaceae)大戟屬(Euphorbia)植物甘遂EuphorbiakansuiT.N.Liou ex T.P.Wang的干燥塊根；具有瀉水逐飲，消腫散結(jié)的功能，用于水腫脹滿，胸腹積水，痰飲積聚，氣逆咳喘，二便不利，風(fēng)痰癲癇，癰腫瘡毒[1]?，F(xiàn)代研究表明，甘遂化學(xué)成分還具有抗腫瘤、抗生育、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等活性[2]。但其毒性較強(qiáng)，臨床使用劑量十分有限，過(guò)量則引起腹痛、腹瀉，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)劇烈嘔吐、血壓下降、脫水和呼吸衰竭等癥狀。甘遂的化學(xué)成分研究表明,其主要有效成分為二萜酯類成分,且活性多樣,尤其是巨大戟萜醇(ingenol)型二萜酯類有顯著的抗癌、抗病毒活性等[3-5]。因此以二萜類成分為指標(biāo)來(lái)控制甘遂的質(zhì)量是十分有意義的。

1 儀器、樣品與試藥

1.1儀器

島津2010型高效液相色譜儀。

1.2樣品與試藥

對(duì)照品甘遂大戟萜酯D(KansuiphorinD)為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)1H-NMR和13C-NMR波譜法鑒別其結(jié)構(gòu)，HPLC歸一化法測(cè)定其純度為98.1%。乙腈為色譜純，甲醇、醋酸乙酯等均為分析純，純凈水為Milli-Q純水。共收集了44批生、制甘遂樣品，樣品收集信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用菲羅門(mén)lunarC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱溫40℃；流動(dòng)相為乙腈-水(70∶30)，流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)235nm；進(jìn)樣量10μL。KansuiphorinD的分離度為2.8，理論塔板數(shù)為9000。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品KansuiphorinD5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得每1mL含KansuiphorinD0.2mg的混合溶液。色譜圖見(jiàn)圖1A。

2.3供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。色譜圖見(jiàn)圖1B。

表1 樣品來(lái)源

圖1 甘遂大戟萜酯D對(duì)照品(A)和生甘遂樣品1(B)HPLC圖

2.4線性關(guān)系的考察

按上述色譜條件，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1，5，10，20，30，40μL，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積。以峰面積值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Kansuiphorin D。得回歸方程為Y=15926894.8030X+1121.3609，r=0.9999，結(jié)果表明，Kansuiphorin D進(jìn)樣量在0.216～8.64μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果KansuiphorinD色譜峰面積的RSD=0.62%。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品的供試品溶液，按上述色譜條件分別于0，2，4，6，8，16h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果KansuiphorinD色譜峰面積的RSD=0.52%。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品6份，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，結(jié)果KansuiphorinD的含量平均值為0.020 %，RSD=1.05 %。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的1號(hào)樣品按1g的50%，100%，150%3個(gè)質(zhì)量等級(jí)稱樣9份，每個(gè)質(zhì)量等級(jí)各3份。分別加濃度為0.2mg·mL-1的3組對(duì)照品甲醇溶液25mL，按供試品溶液制備方法處理得供試液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Kansuiphorin D加樣回收率試驗(yàn)

注：Kansuiphorin D對(duì)照品加入量均為0.201 mg

2.9樣品測(cè)定

取44批甘遂樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定(每個(gè)樣品取樣2份，每份進(jìn)樣2次，總計(jì)n=4)。以外標(biāo)法計(jì)算，按干燥品計(jì)，Kansuiphorin D的含量結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 44批甘遂樣品中Kansuiphorin D含量測(cè)定 /%

注：n=4

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇

分別采用甲醇-水(70∶30)、甲醇-0.03%甲酸溶液(70∶30)、乙腈-水(70∶30)為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果在甲醇-水(70∶30)、甲醇-0.03%甲酸溶液(70∶30)流動(dòng)相系統(tǒng)中，待測(cè)成分與其他化學(xué)成分的色譜峰基線處難以完全分離；最終選用乙腈-水(70∶30)為流動(dòng)相，獲得滿意的分離效果。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

KansuiphorinD結(jié)構(gòu)的紫外光譜最大吸收在235nm，故選擇235nm作為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。其紫外光譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照品DAD光譜圖

3.3柱溫的考察

考察了柱溫為25，30，40℃時(shí)被檢測(cè)成分的分離效果，結(jié)果二萜均可達(dá)到很好的分離效果，R≥1.5。本實(shí)驗(yàn)采用40℃柱溫。

3.4提取溶劑和提取方法的比較

分別以甲醇、醋酸乙酯為提取溶劑制得不同樣品，結(jié)果表明，甲醇提取效率稍高，并且雜質(zhì)干擾少，故采用甲醇作為溶劑來(lái)處理樣品。同時(shí)考察甲醇超聲提取和加熱回流提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取方法樣品含量無(wú)顯著變化，故采用甲醇超聲提取的方法。

3.5提取時(shí)間的選擇

考察了20，30，40min的提取效果，測(cè)定含量。最后確定以40min進(jìn)行超聲處理(功率250W，頻率50kHz)。

3.6提取溶劑量的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了2g樣品分別加醋酸乙酯25，50，100mL進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種溶劑量對(duì)提取效率無(wú)顯著差異，考察到為了提高檢測(cè)信號(hào)，降低基線對(duì)測(cè)定的影響，采用2g樣品加甲醇25mL的方法進(jìn)行提取。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：81-82.

[2] 郭曉莊.有毒中草藥大辭典[M].天津：天津科技翻譯出版公司,1992：739.

[3] 史海明，閔知大，屠鵬飛，等.中國(guó)大戟屬植物中二萜成分的化學(xué)及生物活性[J].化學(xué)進(jìn)展，2008，20(2-3)：375-385.

[4] 宿樹(shù)蘭，段金廒，丁安偉.大戟二萜醇酯類成分及其毒效關(guān)系研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9(4)：67-73.

[5] 修彥鳳,曹艷華,張永太.甘遂的藥理作用研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)雜志,2008，42(4)：79-81.

DeterminationofKansuiphorinDinKansuiRadixanditsProcessedProducts

CHENG Xian-long1, XIAO Xin-yue1, ZOU Qin-wen2, LIU Wei1, SHI Yan1, WEI Feng1, MA Shuang-cheng1, LIN Rui-chao1

(1.NationalInstitutefortheControlofPhamaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China;2.BeijinLianxinPharmaceuticCo.,Ltd,Beijing102628,China)

Objective: To develop an HPLC method for determination of Kansuiphorin D in Kansui Radix and to compare the differences of the contents of euphol and tirucallol in Kansui Radix and its processed product (processed with vinegar) by HPLC.MethodsThe sample was extracted by methanol. HPLC analysis was performed on an lunar C18column, column temperature was40℃.The mobile phase was the system of acetonitrile-water(70∶30). The flow rate was1.0mL·min-1and UV detection was set at235nm.ResultsDetermined the contents of Kansuiphorin D of44samples by HPLC.ConclusionThe methad was simple, rapid and accurate with good productivity, which can be used to determine of Kansuiphorin D in Kansui Radix and its processed product.

Kansui Radix; Processed product (processed with vinegar); Kansuiphorin D; HPLC

2011-04-02)