大孔吸附樹脂法富集純化穿山龍總皂苷工藝研究

張園園，劉瑞，任睿，莫愁

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510000)

工 藝

*張園園，E-mail：choenen@yahoo.com.cn

大孔吸附樹脂法富集純化穿山龍總皂苷工藝研究

張園園1*，劉瑞1，任睿2，莫愁1

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510000)

目的探討大孔吸附樹脂法富集純化穿山龍總皂苷的工藝。方法以洗脫所得總固物的量及總固物中穿山龍總皂苷的含量為考察指標(biāo)，考察樹脂型號(hào)、洗脫溶劑用量等工藝條件與藥材-樹脂比例、色譜柱徑高比、洗脫流速、收集洗脫液的量等工藝參數(shù)。結(jié)果最佳工藝為藥材-樹脂(1∶2)，色譜柱徑高比1∶13，收集8 BV洗脫液的量。總固物得率為5.79 %～6.27 %，穿山龍總皂苷的含量為55.08 %～57.79 %。結(jié)論方法操作簡單、安全、穩(wěn)定，適合廣泛應(yīng)用推廣。

穿山龍；總皂苷；制備工藝

穿山龍為穿龍薯蕷(DioscoreanipponicaMakino的根莖，收載于《中國藥典》，具有祛風(fēng)除濕，舒筋通絡(luò)，活血止痛，止咳平喘的功能。用于風(fēng)濕痹病，關(guān)節(jié)腫脹，疼痛麻木，跌撲損傷，閃腰岔氣，咳嗽氣喘[1]。穿山龍主要含有薯蕷皂苷等多種甾體皂苷類成分，甾體總皂苷為該藥材防治心血管疾病等藥理活性的主要成分[2]，因此尋找一種高效、實(shí)用的提取工藝是將總皂苷作為穿山龍有效部位研究開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。近年來，大孔吸附樹脂廣泛應(yīng)用于天然植物中活性成分如皂苷、黃酮、生物堿等大分子化合物的提取分離，該方法工藝過程安全、成本低、穩(wěn)定、效率高[3]。本研究采用大孔吸附樹脂法分離純化穿山龍總皂苷，以洗脫所得總固物的量及總固物中穿山龍總皂苷的含量為考察指標(biāo)[4]，考察樹脂型號(hào)、洗脫溶劑用量等工藝條件與藥材-樹脂比例、色譜柱徑高比、洗脫流速、收集洗脫液的量等工藝參數(shù)[5]，并與傳統(tǒng)的溶劑萃取法相比較，從而確立富集、純化穿山龍總皂苷可行的方法。

1 儀器、材料和試劑

UV-265FW型分光光度儀(日本島津公司)。D101型大孔吸附樹脂(天津海光化工有限公司)，HPD300、HPD600型大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)。

高氯酸(分析純，上海桃浦化工廠)，α-萘酚(上海試劑三廠)。穿山龍藥材購于北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王學(xué)勇副教授鑒定為穿龍薯蕷(D.nipponicaMakino)的根莖。薯蕷皂苷對(duì)照品為作者從穿山龍中分離純化得到，采用波譜學(xué)等方法(1HNMR、13CNMR，IR)并參考文獻(xiàn)[6-7]確證結(jié)構(gòu)，峰面積歸一化法計(jì)算純度>98%，符合含量測(cè)定要求。

2 穿山龍總皂苷含量測(cè)定方法

采用比色法[8]進(jìn)行測(cè)定。

2.1測(cè)定波長的選擇

高氯酸顯色后，以紫外分光光度計(jì)在190～700nm掃描，薯蕷皂苷及穿山龍總皂苷的吸收曲線基本一致，且都在406nm處有最大吸收峰，而水洗脫液在該波長下無吸收，故選擇406nm為檢測(cè)波長。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品5.5mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.550mg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，置具塞試管中，水浴揮干溶劑，精密加入高氯酸10mL，于60℃水浴加熱15min，冰水終止反應(yīng)，隨行試劑做空白，于406nm處測(cè)定吸光度。以吸光度Y(A)對(duì)濃度X(μg·mL-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=0.0184X-0.0222(r=0.9992)，說明本方法在5.5～55.0μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3供試品溶液的制備與總皂苷含量測(cè)定

精密稱取穿山龍藥材粉末一定量，以20倍體積量的95%乙醇回流提取2次，每次1h。提取液濾過后蒸干，殘?jiān)?倍體積量的10%乙醇溶解，上柱吸附后，洗脫，蒸干洗脫液，甲醇定容，精密吸取一定量，按2.2項(xiàng)下方法自“置具塞試管中”起操作，測(cè)定吸光度，代入回歸方程，以薯蕷皂苷的量計(jì)算穿山龍總皂苷含量。

3 工藝參數(shù)考察與優(yōu)化

3.1樹脂保留體積的計(jì)算

分別稱取等量的不同型號(hào)的大孔樹脂，以95%乙醇上柱，計(jì)算保留體積與樹脂干重比例大約為1∶1(V∶M)。樹脂經(jīng)95%乙醇清洗后，以蒸餾水洗至無醇味，待用。

3.2大孔吸附樹脂型號(hào)的選擇

精密稱取等量穿山龍藥材粉末4份，依2.3項(xiàng)提取、蒸干后，1份直接測(cè)定總皂苷含量，以稱樣量換算成另外3份的“吸附前藥液中總皂苷含量”。另外3份以蒸餾水溶解后，分別加于依3.1項(xiàng)處理好的不同型號(hào)的樹脂柱上，反復(fù)吸附12h，取吸附后的藥液，測(cè)定總皂苷含量作為“吸附后藥液中總皂苷含量”。吸附后的樹脂用蒸餾水洗至Molish反應(yīng)呈陰性，以10倍樹脂保留體積的95 %乙醇洗脫，取解吸后的藥液，測(cè)定總皂苷含量作為“洗脫液中總皂苷含量”。不同型號(hào)樹脂對(duì)穿山龍總皂苷的吸附率及洗脫率見表1，結(jié)果表明D101型大孔樹脂對(duì)穿山龍總皂苷的吸附及解吸均優(yōu)于其他二者，故選擇D101型大孔樹脂用于總皂苷的制備。

表1 各種型號(hào)樹脂對(duì)穿山龍總皂苷的吸附率及洗脫率

3.3洗脫溶劑的選擇

將一定量穿山龍供試液加于已處理好的D101型大孔樹脂，蒸餾水洗至Molish反應(yīng)呈陰性(消耗蒸餾水的量約為20BV)，依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗脫5個(gè)保留體積，每個(gè)保留體積收集1份，每份精密吸取一定量，蒸干溶劑后加高氯酸顯色，測(cè)定總皂苷含量，以洗脫液序號(hào)X(N)為橫坐標(biāo)，每份洗脫液中總皂苷的含量Y(mg)為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，見圖1。

1～5號(hào)為10 %乙醇洗脫部分 5～10號(hào)為30 %乙醇洗脫部分 10～15號(hào)為50 %乙醇洗脫部分 15～20號(hào)為70 %乙醇洗脫部分 20～25號(hào)為95 %乙醇洗脫部分圖1 穿山龍總皂苷大孔吸附樹脂梯度洗脫曲線圖

洗脫曲線顯示穿山龍總皂苷主要集中在30%～70%乙醇洗脫液中，占全部乙醇洗脫液中總皂苷的81.10%。為了使上柱藥液澄清，避免柱堵塞，采用10%乙醇溶解樣品，確定洗脫條件為先用10BV10%乙醇洗去水溶性雜質(zhì)，再用70%乙醇洗脫穿山龍總皂苷，收集70%乙醇洗脫部分。

3.4樹脂分離條件正交試驗(yàn)

以洗脫所得總固物得率及總固物中總皂苷的含量為指標(biāo)，考察藥材-樹脂比例、色譜柱徑高比和收集洗脫液的量3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，采用L9(34)正交表(見表2)安排試驗(yàn)進(jìn)行操作。將收集的洗脫液合并，揮干，40℃烘箱恒重，計(jì)算總固物得率；將總固物以甲醇溶解、定容，精密吸取一定量后蒸干溶劑，加高氯酸顯色，測(cè)定總固物中穿山龍總皂苷的含量，結(jié)果見表3。

表2 穿山龍總皂苷提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

3.5結(jié)果分析

3.5.1直觀分析 表3結(jié)果表明各因素對(duì)總固物得率的影響為A>C>B，最佳水平組合為A3B1C3。各因素對(duì)總皂苷含量的影響為A>B>C，最佳水平組合為A2B3C2。

表3 穿山龍總皂提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.5.2 方差分析 表4方差分析結(jié)果表明A因素對(duì)總固物的得率和總皂苷的含量均有顯著影響，B因素只對(duì)總皂苷的含量有顯著影響，C因素對(duì)兩指標(biāo)均無顯著性影響。

表4 方差分析表

注：(1)n=2,(2)*P<0.05

3.5.3 綜合分析 綜合考慮各因素對(duì)2個(gè)考察指標(biāo)的影響，考慮在大規(guī)模生產(chǎn)中節(jié)約樹脂及溶劑，縮短生產(chǎn)周期，確定最佳分離條件為A2B3C2，即藥材-樹脂比例(1∶2)，色譜柱徑高比1∶13，收集8 BV洗脫液的量。

3.6重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按最佳條件，稱取相同重量的穿山龍藥材3份，提取后以10%乙醇溶解，加于已處理好的大孔樹脂(樹脂用量為藥材的2倍，色譜柱徑高比1∶13)上，先以10BV的10%乙醇洗脫除糖后，用70%乙醇洗脫，收集8BV量的洗脫液，洗脫液蒸干后比色法測(cè)定穿山龍總皂苷的含量，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

注：n=3

4 討論

在考察樹脂型號(hào)時(shí)，選擇了D101型、HPD300型、HPD600型3種不同極性的大孔吸附樹脂，結(jié)果表明非極性的D101型更適合穿山龍總皂苷的富集純化。原因?yàn)樵碥盏能赵糠譃樵魉?，能被非極性樹脂所吸附，同時(shí)皂苷分子較大，孔徑較大的D101型非極性吸附樹脂較適合[9]。

由于藥液中若有懸浮的微粒存在，有可能堵塞大孔樹脂表面的微孔，影響吸附，故上柱前的藥液需經(jīng)過澄清處理。穿山龍總皂苷在水中溶解較差，以水溶解后，離心或過濾后上柱會(huì)造成較大損失。采用10%乙醇溶解，溶液較澄清，可直接上柱，且由吸附曲線看出，10%乙醇洗脫液中總皂苷含量很小，故選擇10%乙醇溶解后上柱。

總皂苷中各種皂苷化學(xué)性質(zhì)雖屬同類成分，分子量差異卻較大，如薯蕷皂苷(M=858)，原薯蕷皂苷(M=1078)。采用比色法測(cè)定總皂苷時(shí)，以分子量低者為參照計(jì)算則含量很低，以分子量高者計(jì)算含量則很高，甚至可能超過100%，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果與實(shí)際相差懸殊。參考穿山龍指紋圖譜研究結(jié)果，薯蕷皂苷(螺甾式三糖苷)在RP-HPLC系統(tǒng)中保留較強(qiáng)，推測(cè)其為總皂苷中極性較小的皂苷，而其他大部分皂苷極性都大于薯蕷皂苷，可能為分子量也大于薯蕷皂苷的三糖呋甾皂苷或三糖以上皂苷，導(dǎo)致以薯蕷皂苷為參照測(cè)定總皂苷含量較低。

實(shí)驗(yàn)中還比較了大孔吸附樹脂法與傳統(tǒng)的正丁醇萃取法富集穿山龍總皂苷，無論總固物的得率，還是總固物中總皂苷的含量，大孔吸附樹脂法均優(yōu)于正丁醇萃取法，且所得總皂苷顏色較淺，收率較高。而且該法克服了傳統(tǒng)工藝存在的有機(jī)溶劑消耗多、萃取易乳化、糖和色素等雜質(zhì)除不完全等缺點(diǎn)。操作簡單、安全、穩(wěn)定，適合廣泛應(yīng)用推廣。

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OptimizationofthePurificationofTotalSaponinsfromDioscoreanipponicabyMacroporousResin

ZHANG Yuan-yuan1, LIU Rui1, REN Rui2, MO Chou1

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeiingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;2.GuangdongInstituteforDrugControl,Guangzhou510000,China)

Objective: The optimal technical parameters for total saponins purification with macroporous resin was studied.MethodsOrthogonal test was used to screen the optimal conditions in terms of extraction yield and purity of saponins.ResultsThe optimal condition was as follows: the ratio of total saponins and macroporous resin was1∶2,the resin column diameter-height ratio was1∶13and the amount of desorption solvent was8BV.The extraction yield of total saponins was5.79%～6.27% and the purity reached55.08%～57.79%.ConclusionThe technique was simple,feasible and suitable for industry production.

Dioscorea nipponica; Total saponins; Technique conditions

2011-03-07)