HPLC法測(cè)定苦參中苦參堿的含量

北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司（100079）王春燕

苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait. 的干燥根。功效為清熱燥濕，殺蟲(chóng)，利尿。用于熱痢，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡，皮膚瘙癢，疥癬麻風(fēng)；外治滴蟲(chóng)性陰道炎。筆者建立了高效液相色譜法測(cè)定苦參中苦參堿的含量，現(xiàn)報(bào)告如下：

附表1 線(xiàn)性關(guān)系考察

附表2 精密度試驗(yàn)

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

1 儀器與試藥

儀器 Angilent 1100 高效液相色譜儀；色譜柱Angilent ZORBAX Eclips Plus C18（4.6×250mm，5um）；薄層板：青島海洋化工廠(chǎng)；苦參堿對(duì)照品：110805-200306由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；樣品：外購(gòu)；試劑：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液的試劑均為分析純，液相色譜用試劑為色譜級(jí)試劑，液相用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分析條件 流動(dòng)相：四氫呋喃—0.3%十二烷基硫酸鈉（用磷酸將pH調(diào)值調(diào)至3.0）（21：79）。流速：1.0ml/min。柱溫：20℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。進(jìn)樣量：對(duì)照品5ul，樣品5ul。層析柱的理論板數(shù)：以苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末0.3g，精密稱(chēng)定，置100ml 磨口三角瓶中，加入乙醇20ml，濃氨水0.5ml，密塞，超聲提?。üβ?50W，頻率40Hz）20分鐘，提取液用濾紙過(guò)濾，藥渣和濾紙用乙醇洗滌3 次，每次5ml，合并濾液，于75℃水浴中回收溶劑，殘?jiān)昧鲃?dòng)相定容至10ml量瓶中，搖勻。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

附圖1 苦參堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密稱(chēng)取苦參堿對(duì)照品18.9mg，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取苦參堿對(duì)照品溶液（0.756mg/ml）0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml置25ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別吸取對(duì)照品溶液10ul注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積，結(jié)果見(jiàn)附表1。以對(duì)照品進(jìn)樣量（ug）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（見(jiàn)附圖1），結(jié)果表明苦參堿在0.0756～0.756ug范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。回歸方程為Y=1697.18558X+0.251635，r=0.99998（n=6）。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD ＜ 3%，結(jié)果見(jiàn)附表2。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按正文方法，對(duì)同一批樣品6份，進(jìn)行測(cè)定，RSD ＜ 3%，結(jié)果見(jiàn)附表3。

2.6 空白試驗(yàn) 空白溶液的制備是按處方中藥味比例，自配不含苦參的其他藥材，按其工藝制成空白制劑，再按【含量測(cè)定】項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備并測(cè)定，空白溶液在與苦參堿對(duì)照品相同保留時(shí)間處未顯色譜峰，故認(rèn)為空白無(wú)干擾（見(jiàn)附圖2）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按正文方法對(duì)同一批樣品分別于配制后0，1，2，6，12，24小時(shí)，依法測(cè)定，結(jié)果表明，供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。RSD ＜ 3%。

2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法。精密稱(chēng)取已知含量的同一批號(hào)樣品0.2g，置100ml三角瓶中，共6份，分別精密加入苦參堿對(duì)照品溶液（0.750mg/ml）1.0ml，按照正文供試品溶液的制備方法制備及上述色譜條件測(cè)定，按下式計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)附表4。

附表4 回收率試驗(yàn)

附表5 樣品測(cè)定結(jié)果

3 樣品測(cè)定結(jié)果

取3批樣品，分別按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按正文含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)附表5（苦參堿對(duì)照品色譜圖見(jiàn)附圖3，苦參色譜圖見(jiàn)附圖4）。

4 討論

4.1 苦參是一種常用的中藥材，中國(guó)藥典2010版中苦參【含量測(cè)定】采用氨基色譜柱分離，因?yàn)殛P(guān)于用ODS色譜柱分離苦參中苦參堿的報(bào)道很多，ODS色譜柱現(xiàn)使用較普遍，所以選用了ODS色譜柱。

附圖2 苦參的苦參空白的高效液相色譜圖

附圖3 苦參堿對(duì)照品高效液相色譜圖

4.2 流動(dòng)相選擇為四氫呋喃—0.3%十二烷基硫酸鈉（21：79），比較樣品在不同pH值的流動(dòng)相中的分離情況，結(jié)果磷酸調(diào)pH值至3.0的苦參堿峰的分離度合格（R＞1.5），而且分離效果最佳。

4.3 比較樣品在不同濃度0.2%、0.3% 、0.4% 的十二烷基硫酸鈉的離子對(duì)試劑的流動(dòng)相中的分離情況，結(jié)果四氫呋喃—0.3%十二烷基硫酸鈉（21：79，磷酸調(diào)pH值至3.0）的保留因子適宜，分離效果最佳。

4.4 比較樣品在不同柱溫20℃、25℃、30℃時(shí)的分離情況，結(jié)果柱溫20℃時(shí)，苦參堿峰的分離效果最佳。

4.5 比較了水、甲醇和流動(dòng)相為定溶溶劑的圖譜，結(jié)果表明：以流動(dòng)相為定溶溶劑，基線(xiàn)穩(wěn)定，系統(tǒng)適應(yīng)性強(qiáng)，樣品無(wú)需氧化鋁萃取小柱凈化，從而簡(jiǎn)化了樣品處理過(guò)程。

附圖4 苦參高效液相色譜圖