菊苣中菊苣酸提取工藝優(yōu)化

華 春，李建玲，周 峰，周泉澄，張邊江，王仁雷*，趙夢(mèng)丹(.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 7；.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 0046；3.江蘇教育學(xué)院，江蘇 南京 003)

菊苣中菊苣酸提取工藝優(yōu)化

華 春1，李建玲2，周 峰1，周泉澄1，張邊江1，王仁雷3,*，趙夢(mèng)丹2
(1.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211171；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046；3.江蘇教育學(xué)院，江蘇 南京 210013)

以荷蘭菊苣為材料，采用高效液相色譜法測(cè)定菊苣酸的含量，建立菊苣酸提取工藝優(yōu)化方法。通過單因素試驗(yàn)分析回流溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間及料液比4個(gè)主要因素對(duì)菊苣酸提取量的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化菊苣中菊苣酸提取工藝條件。結(jié)果表明：菊苣中菊苣酸的最佳提取工藝為回流溫度60℃、70%甲醇、料液比1:60(g/mL)、回流1h。在此條件下菊苣中菊苣酸提取量為8.808mg/g(干質(zhì)量)。關(guān)鍵詞：菊苣；菊苣酸；提取工藝；高效液相色譜法

菊苣(Cichorium lntybusL.)為菊科(Asteraceae Compositae)菊苣屬(CichoriumL.)一年生或多年生草本植物。菊苣耐鹽堿，在土壤含鹽量0.168%時(shí)生長(zhǎng)良好[1]，在江蘇的沿海灘涂廣泛分布。菊苣地上部分的葉片含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、糖類、黃酮、菊苣酸、多種維生素等生物活性成分，是一種新型的保健海水蔬菜。肉質(zhì)根含有菊粉(Inulin)、綠原酸和苦味酸等，是工業(yè)和藥品的生產(chǎn)原料[2-3]。菊粉是一種功能性低聚果糖，也是一種可溶性膳食纖維，對(duì)控制人的體質(zhì)量、改善腸道功能、防止機(jī)體失調(diào)以及老年性疾病很有幫助[4]。綠原酸和苦味酸能增加咖啡的溶解質(zhì)量，緩和咖啡的刺激作用[5]，因而成為咖啡的添加物和替代品。菊苣的地上部分和地下塊根加工后的殘?jiān)呛芎玫娘暳?，其無氮浸出物、粗蛋白、粗灰分、粗纖維和脂肪5項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)的含量均高于玉米[6-7]。菊苣酸是菊苣莖葉中一種重要的免疫活性成分之一，近年來藥理研究表明，菊苣酸具有增強(qiáng)免疫功能和抗炎作用[8]，并能抑制透明質(zhì)酸酶，保護(hù)膠原蛋白免受可致降解的自由基的影響[9]，還具有抑制HIV1和HIV2整合酶[10]，促進(jìn)胰島素釋放[11]的作用。作為一種寶貴的植物資源，菊苣的開發(fā)利用具有廣闊前景。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菊科其他植物中菊苣酸的研究有一定進(jìn)展，對(duì)其提取工藝的優(yōu)化研究已有報(bào)道[12]，而對(duì)菊苣中菊苣酸提取工藝及測(cè)定研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)菊苣地上部分菊苣酸提取的研究，探討最佳提取工藝，為開發(fā)利用新型保健海水蔬菜菊苣提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菊苣(Cichorium lntybusL.)種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院提供提供。在溫度23℃，濕度88%的人工氣候室中用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液沙培生長(zhǎng)30d。取其地上部分，37℃恒溫干燥箱24h烘干，粉碎過40目篩備用。

菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%) 中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)。

LC-20AT型高效液相色譜儀 日本島津公司；LAC164型電子分析天平 上海精科公司；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海博訊公司；Milli-Q超純水儀南京易普易達(dá)公司。

1.2 方法

1.2.1 菊苣酸提取工藝

精密稱取0.2g菊苣地上部分干粉，置于圓底燒瓶中，按照設(shè)定的料液比加入甲醇溶液，水浴回流，提取液濾紙過濾，再過0.25μm的微孔濾膜，濾液待用。

通過單因素試驗(yàn)分析回流溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間及料液比4個(gè)因素對(duì)菊苣酸提取量的影響，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化菊苣中菊苣酸提取工藝條件。

1.2.2 色譜條件

色譜柱Zorbax SB C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(25:75)，流速0.7mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)335nm，進(jìn)樣量20μL[13]。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品5mg，置50mL容量瓶中，精密加入70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過微孔濾膜待用，即得質(zhì)量濃度0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取質(zhì)量濃度0.1mg/mL的菊苣酸對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于5mL容量瓶中，精密加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸收20μL注入HPLC儀中，按照1.2.2節(jié)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及其峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，菊苣酸質(zhì)量濃度(X)/(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝5.1×107X－13353，r＝0.9995，線性范圍0.02～0.1mg/mL。

1.2.5 菊苣酸含量測(cè)定

圖1 菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard cichoric acide

精密稱取菊苣地上部分干粉0.2g，按照1:70料液比加入70%甲醇，50℃回流提取1.5h，提取液過濾，過濾后的提取液以0.25μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。按照1.2.2節(jié)色譜條件測(cè)定峰面積，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得樣品菊苣酸的質(zhì)量濃度。做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。樣品色譜圖見圖2。

樣品菊苣酸含量/mg＝樣品中菊苣酸質(zhì)量濃度×提取液體積

圖2 樣品中菊苣酸色譜圖Fig.2 Chromatograph of cichoric acid in extract samples

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL，測(cè)得菊苣酸的峰面積，重復(fù)5次，計(jì)算得RSD＝1.01%，n＝5。

1.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度0.087mg/mL樣品溶液，每隔1h進(jìn)樣20μL，測(cè)得峰面積，重復(fù)5次，計(jì)算得RSD＝1.33%，n＝5。

1.2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收法[15]，取已知含量的樣品5份，分別添加菊苣酸對(duì)照品，按樣品制備法制備供試液，按照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為1.061，RSD＝1.33%，n＝5。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 回流溫度對(duì)提取效果的影響

精密稱取菊苣地上部分干粉0.2g，放入150mL圓底燒瓶中，按照1:50的料液比加入70%甲醇10mL，然后分別在40、50、60、70、80、90℃水浴條件下回流1.5h?；亓魈崛∫?，濾紙過濾，再過0.25μm微孔濾膜，計(jì)算濾液中菊苣酸提取量。

圖3 回流溫度對(duì)菊苣酸提取量的影響Fig.3 Effects of reflux temperature on cichoric acid yield

由圖3可見，隨著回流溫度的增高呈先增加后下降的變化規(guī)律?；亓鳒囟?0、50、60℃對(duì)菊苣酸提取量的影響不顯著(P＞0.05)，60、70、80、90℃對(duì)菊苣酸提取量影響極顯著(P＜0.01)，回流溫度50℃時(shí)提取效果最好，菊苣酸提取量為7.485mg/g。因此，確定最佳回流溫度為50℃。

2.2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

在其他條件不變的情況下，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%對(duì)提取效果的影響。

圖4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸提取量的影響Fig.4 Effects of methanol concentration on cichoric acid yield

由圖4可見，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的提高而呈先增加后下降的變化規(guī)律。甲醇體積分?jǐn)?shù)50%和60%對(duì)菊苣酸提取量的影響不顯著(P＞0.05)，70%、80%、90%甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸提取量影響極顯著(P＜0.01)，其中甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取效果最好，菊苣酸提取量為7.485mg/g。因此，甲醇體積分?jǐn)?shù)70%最好。

2.3 回流時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在其他條件不變的情況下，考察回流時(shí)間分別1.0、1.5、2.0、2.5h對(duì)提取效果的影響。

圖5 回流時(shí)間對(duì)菊苣酸提取量的影響Fig.5 Effects of reflux duration on cichoric acid yield

由圖5可見，回流時(shí)間對(duì)菊苣酸提取量的影響明顯，隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律?；亓鲿r(shí)間與菊苣酸提取量的關(guān)系顯著(P＜0.05)，其中回流時(shí)間為1.5h時(shí)，提取效果最好，菊苣酸提取量為7.485mg/g。與其他因素水平差異顯著(P＜0.05)。因此，選定回流時(shí)間為1.5h。

2.4 料液比對(duì)提取效果的影響

在其他條件不變的情況下，考察料液比分別為1:40、1:50、1:60、1:70、1:80(g/mL)對(duì)提取效果的影響。

圖6 料液比對(duì)菊苣酸提取量的影響Fig.6 Effects of solid-to-liquid ratio on cichoric acid yield

由圖6可見，溶劑用量對(duì)菊苣酸提取量的影響明顯，隨著提取溶劑用量增大而先上升后下降。1:40、1:50、1:60(或1:70)、1:80料液比與菊苣酸提取量的關(guān)系極顯著(P＜0.01)，1:60和1:70的料液比對(duì)菊苣酸提取量的影響不顯著(P＞0.05)。料液比為1:70時(shí)，提取效果最好為8.732mg/g。由于隨著提取溶劑用量的增大試驗(yàn)誤差增大，且從節(jié)約資源的角度考慮，選擇1:60為最佳料液比。

2.5 菊苣酸提取工藝正交試驗(yàn)

對(duì)影響菊苣酸提取量的4個(gè)因素：回流溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間及料液比進(jìn)行三水平四因素正交試驗(yàn)。因素水平安排表1，結(jié)果見2。

表1 菊苣酸提取工藝正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test design

表2 菊苣酸提取工藝L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of L9(34) orthogonal test

從表2極值可知，4個(gè)因素對(duì)菊苣中菊苣酸的提取量均有影響，各因素影響的主次順序是：回流溫度＞甲醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞回流時(shí)間。提取菊苣中菊苣酸的最佳工藝為：回流溫度60℃、70%甲醇、回流時(shí)間1h，料液比1:70，菊苣酸提取量為8.537mg/g。從節(jié)約能源和減少誤差的角度考慮，料液比宜采用1:60。按照最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，菊苣酸提取量為8.808mg/g，說明所選取的工藝確實(shí)為最佳工藝。

3 討 論

3.1 通過單因素和L9(34)正交試驗(yàn)確定了提取菊苣酸的的最佳工藝條件：回流溫度60℃、70%甲醇、回流時(shí)間1h、料液比1:60，菊苣酸提取量為8.808mg/g。菊苣酸提取量為穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(RSD＝1.33%)表明該提取工藝穩(wěn)定性好。另外，操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本較低的優(yōu)點(diǎn)，為菊苣的研究與開發(fā)打下必要的基礎(chǔ)。

3.2 菊苣中菊苣酸的提取一般采用水、甲醇、乙醇、色譜級(jí)甲醇或超臨界萃取，由于水提取溫度較高，容易造成菊苣酸的氧化[16]且效率低；乙醇易揮發(fā)易燃燒，濃度高時(shí)組織內(nèi)的菊苣酸溶解度降低導(dǎo)致菊苣酸不能提取出來[16]；普通分析甲醇提取容易造成有機(jī)溶劑殘留，降低產(chǎn)品的質(zhì)量[12]；超臨界萃取成本較高，收率低，尚未完成工業(yè)化研究[12]。本實(shí)驗(yàn)采用色譜級(jí)甲醇為提取溶劑，不含雜質(zhì)，提取效果好，成本較低。

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Process Optimization for Cichoric Acid Extraction fromCichorium lntybusL. Shoots

HUA Chun1，LI Jian-ling2，ZHOU Feng1，ZHOU Quan-cheng1，ZHANG Bian-jiang1，WANG Ren-lei3,*，ZHAO Meng-dan2

(1. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 211171, China；2. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；3. Jiangsu Institute of Education, Nanjing 210013, China)

The purpose of this study was to optimize the extraction of cichoric acid fromCichorium lntybusL. by methanol reflux extraction and then establish an HPLC method for determining cichoric acid content inCichorium lntybusL. One-factorat-a-time experiments were conducted to understand the effects of reflux temperature, methanol concentration, extraction time and solid-to-liquid ratio on extraction efficiency of cichoric acid. Based on this, an L9 (34) orthogonal array design was employed to optimize extraction efficiency of cichoric acid. The results demonstrated that the optimal conditions for cichoric acid extraction were reflux temperature of 60 ℃, solid-to-liquid ratio of 1:60 (g/mL), methanol concentration of 70%, and reflux duration of 1 h. Under the optimal conditions, the extraction efficiency of cichoric acid was 8.808 mg/g dry basis.

Cichorium lntybusL.；cichoric acid；process optimization；HPLC

R284.2

A

1002-6630(2011)20-0126-04

2011-06-29

江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(KJD180118)；江蘇省植物生理學(xué)精品課程建設(shè)項(xiàng)目(2010)；江蘇省現(xiàn)代教育技術(shù)研究重點(diǎn)課題(2010)；南京市環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2011)

華春(1963—)，女，教授，本科，研究方向?yàn)橹参锬婢成?。E-mail：hc3501988@163.com

*通信作者：王仁雷(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锬婢成?。E-mail：wrl3501988@163.com